1青钱柳种子无菌萌发研究【摘要】 目的探讨不同处理方式对青钱柳种子无菌萌发的影响。方法浓硫酸对种子进行预处理后，采用正交设计对影响其萌发的 GA3浓度、浸种温度和浸种时间进行研究，再将外植体进行消毒，接种于不同激素组合的 MS 培养基中进行无菌培养。结果青钱柳种子萌发的最佳处理为：浓硫酸酸蚀 9.5h+1000mg/L 的 GA3 溶液+浸种24h+浸种温度 35;种子萌发的最优激素组合为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+ GA3 30 mg/L;对青钱柳幼苗进行离体培养，液体培养基比固体培养基更有利于青钱柳的离体培养。结论对青钱柳种子进行了综合处理再进行无菌培养，可以提高青钱柳种子的发芽率。 【关键词】 青钱柳种子; 激素; 萌发; 无菌培养青钱柳 Cyclocarya paliurus (Batal.)Iljinskaja 又名摇钱树、山沟树(浙江) 、麻柳( 湖北 )、青钱李等， 系胡桃科青钱柳属植物，为我国特有的珍稀树种，是国家重点保护的濒危植物之一1，2 ，在广西桂林等地也有分布。青钱柳有降血糖、降血压、降血脂等作用，被认为是治疗 2 型糖尿病的安全低毒的良药。现有的青钱柳多零星分布于深山老林和一些自然保护区中，2主要是天然林，青钱柳种子发育差， 种子败育很严重且具有深休眠特性，人工育苗出苗率低，一般播种后需隔年甚至 2 年后才萌发3，坚硬种壳是阻碍种子萌发的因素之一4，这在一定程度上制约了青钱柳人工资源的培育和开发利用，严重影响了青钱柳的开发与产业化进程。目前有关青钱柳种子萌发的研究报道并不多，本试验以青钱柳种子为外植体，采用浓硫酸软化种子种壳，结合赤霉素浸泡后进行无菌培养，探讨浓硫酸、赤霉素综合处理及培养基激素等因素对青钱柳种子萌发的影响，探讨提高青钱柳种子发芽率的方法。1 材料青钱柳种子由桂林医学院药理教研室提供(2005 年采集于桂林资源县中峰乡野生青钱柳植株)。2 方法2.1 种子的预处理 4 条件下，用浓硫酸分别浸泡种子4.5，9.5，13.5 h，自来水下将种子表面黑色碳化物搓洗干净，经消毒后接种于不含激素的固体培养基中，以清水浸种作为对照。2.2 种子的综合处理采用正交实验设计，对 GA3 浓度、浸种时间和浸种温度均设 3 个水平，分别为：GA3 浓度设3100， 500， 1000 mg/L;GA3 浸种时间设 12，24 ，48 h;浸种温度设 5，25 ， 35 。种子综合处理方案见表 2。2.3 种子的消毒和接种将处理过的种子用清水洗净，于 75%酒精中浸泡 1 min，转入 0.1%升汞浸泡 15 min，无菌水清洗 4 次后，接入培养基，每一处理接种 20 颗种子。2.4 初代培养培养基为固体培养基，激素组合采用正交实验设计，设计方案见表 3。2.5 继代培养当青钱柳幼苗长至 46cm 高时，将根尖和萌发芽剪下(长度约为 2 cm 左右)，分别接入激素水平为 6BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 的固体培养基和液体培养基中。2.6 培养基的设计 MS 为基本培养基，附加 3%的蔗糖，固体培养基附加 0.7%的琼脂，培养基灭菌前将 pH 值调至 5.86.0。2.7 培养条件接种后先进行暗培养，种子萌芽后转为光照培养，光照时间 12h/d，光强 1 5002000 Lx，培养温度为(25 0.5) 。2.8 实验结果的统计和计算每一处理在接种后定期观察、记4录种子的污染情况和生长情况，分别记录接种 20，40 ，60 d 种子的发芽情况，接种 60 d 时统计发芽率：发芽率(%)=萌芽种子数/未受污染的接种数100%。3 结果3.1 浓硫酸酸蚀时间对青钱柳种子萌发的影响青钱柳不经酸蚀，种壳对种子的萌发产生了很大的阻力，发芽率为 0(结果见表 1)。用浓硫酸进行不同时间的酸蚀后，酸蚀 4.5 ，9.5 h 两个处理中均有种子发芽，以 9.5 h 的发芽率最高，说明在一定范围内，随酸蚀时间的延长，种子的发芽率升高，但酸蚀时间过长，酸蚀 13.5 h，会导致种子胚的损坏，最终导致种子无法萌发。表 1 浓硫酸对青钱柳种子萌发的影响3.2 不同浓度 GA3、浸种时间和浸种温度对青钱柳种子萌发的影响不同浓度的 GA3 浸种可显著促进种子萌发，有效解除种子休眠5。正交实验结果表明，综合处理可促进种子萌发，但发芽时间和发芽率有差异，A8 处理的青钱柳种子发芽时间最早，17 d 就可以看到种子发芽，60 d 时发芽率可达 42.11%， A9 处理发芽时间最迟，1 个月才发芽，且发芽率仅为 10.53%(见表 2)，说明 A8 处理能较快地打破青钱柳种子休眠和提高青钱柳的发芽率;极差分析表明，GA3 浓度产生影响的极差最大，浸种温度的极差值最小，浸种时间次之，说明 GA3 的浓度对青钱柳种子发芽率影响最大，温度对5青钱柳种子的发芽率影响最小，优化组合为 GA3 1000mg/L+浸种24 h+浸种温度 35。3.3 不同激素种类及浓度对青钱柳种子萌发的影响不同的外源激素及其不同处理浓度对种子发芽势有明显影响6，本试验通过正交设计探讨不同激素组合对青钱柳种子萌发的影响，结果表明，B6 处理种壳出现裂缝及发芽时间最早(15d)，发芽率最高，可达66.67%，B7 和 B9 发芽率次之(36.84%); 发芽数率最低的为 B2，发芽率仅为 10.53%(见表 3)。极差分析表明，6-BA 产生的影响极差最大，其次是 NAA 和 GA3，说明三者对青钱柳种子萌发影响的大小依次为：6-BANAAGA3，比较均值可得青钱柳种子萌发的最优培养基配方是:MS+6-BA 0.5mg/L + NAA 0.1mg/L + GA3 30 mg/L。表 2 GA3 浓度、浸种时间和浸种温度对种子萌发的影响表 3 GA3 浓度、浸种时间和浸种温度对种子萌发的影响3.4 培养基状态对青钱柳幼苗继代的影响当青钱柳幼苗长至4cm 高时，将根尖和萌发芽剪下(长度约为 2 cm 左右)，分别接入激素水平为 6-BA 2.0mg/L+NAA0.1mg/L 的固体培养基和液体培养基中，其生长情况见表 4。在固体培养基中，所转接的根和芽在接种 21 d 后均发生褐变和死亡。在液体培养基中，所转接的根在培养 7 d 后，根基部即产生愈伤组织，并逐渐膨大，培养至 21 d 时愈伤组织变黄;芽转入增殖培养基后，生长良好，培养至 14 d 就长出6两个侧芽，继续培养则形成丛生芽，说明同一激素配方，液体培养基更有利于青钱柳幼苗的继代培养。表 4 培养基状态对青钱柳幼苗继代的影响4 讨论青钱柳是我国特有的、集药用、材用和观赏等多种价值于一身的单种属珍贵树种，其种子具有深休眠特性，一般播种后需隔年甚至 2 年后才萌发，研究表明，综合处理措施可以有效解除种子休眠，缩短发芽时间7，尚旭岚等8通过浓硫酸酸蚀再剥取离体胚进行培养，获得了一定数量的再生植株，为青钱柳的快速繁殖提供了一种新的方法，但该试验对于 GA3 的影响，仅考虑了其浓度，并未将浸种温度、时间的影响因素考虑在内;在培养基的设计方面，激素水平也只涉及 GA3;此外，由于青钱柳种子较小且坚硬，剥取离体胚具有一定的难度，本试验通过酸蚀预处理，浓硫酸对种子进行预处理后，采用正交设计对影响其萌发的 GA3 浓度、浸种温度和浸种时间进行研究，再将消毒的种子直接接种于正交设计的不同激素组合的 MS 培养基中进行无菌培养，经比较分析得出适合青钱柳萌发的最佳处理为：浓硫酸酸蚀 9.5h+1000mg/L 的 GA3 溶液+浸种24h+浸种温度 35;种子萌发的最优激素组合为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+ GA3 30mg/L。7本试验对种子进行酸蚀和综合处理后直接进行无菌培养，不仅减少了剥离种胚的操作步骤，而且与传统的通过沙子层积打破种子休眠获得种苗相比，可直接得到无菌苗进行快速繁殖，为进一步探讨青钱柳种苗的规模化生产奠定了基础。【参考文献】1 谢明勇，李 磊.青钱柳化学成分和生物活性研究概况J.中草药，2001，32(4)：365.2 方升佐，杨万霞.青钱柳的开发利用与资源培育J.林业科技开发，2003，17(1)：49.3 杨万霞，洑香香，方升佐，等. 青钱柳种子的种皮构造及其对透水性的影响J. 南京林业大学学报(自然科学版)，2005，29(5):25.4 史晓华，徐本美，黎念林，等.青钱柳种子休眠与萌发的研究J.种子，2002，5:5.5 刘自刚.外源激素破除桔梗种子休眠的方法研究J. 安徽农业科学，2008，36(20)：8458.86 潘学军，张文娥，樊卫国，等.外源激素处理对贵州毛葡萄种子发芽的影响J.种子，2007，26(1)：25.7 Shengzuo Fang ， Jiayuan Wang， Zhaoyang Wei， et al. Methods to break seed dormancy in Cyclocarya paliurus (Batal) Iljinskaja J. Scientia Horticulturae， 2006， 110:305.8 尚旭岚，徐锡增，方升佐. 青钱柳离体胚的培养及快速繁殖J.南京林业大学学报 (自然科学版)，2007，31(1)：101.