1多糖类药物的分析一、概述 二、多糖的纯度测定 三、多糖分子量测定 四、多糖的含量测定 五、多糖类药物的结构分析.2第一节 概述1从动物来源的多糖。n2从微生物来源的多糖。n3从植物来源的多糖。n4. 从海洋生物来源的多糖。 3组成分类：n均一多糖n不均一多糖:不同类型的单糖缩合而成n粘多糖：含氮的不均一多糖n结合糖：肽聚糖、糖蛋白(glycoproteins)和蛋 白聚糖n糖蛋白通过糖肽键(carbohydrate-peptide linkage)n将糖链和肽链两部分连接起来,连接方式主要分 为-构型的N-糖苷键和-构型的O-糖苷键.4糖蛋白有三种主要类型糖蛋白有三种主要类型n糖蛋白分为三种主要类型：O-糖苷键型糖蛋白、N-糖 苷键型糖蛋白和连有磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白。n在大多数的O-糖苷键型糖蛋白中，GalNAc残基通过O- 糖苷键与一个丝氨酸或苏氨酸残基连接形成，缩写为 GalNAc-Ser/Thr。n在N-糖苷键型糖蛋白中，GlcNAc残基通过N-糖苷键与 一个天冬酰胺残基相连，缩写为GlcNAc-Asn。5O-糖苷键N-糖苷键O- （N-）糖苷键型糖蛋白6磷酸乙醇胺残基磷脂酰肌醇-聚糖的糖 蛋白7蛋白聚糖n 软骨蛋白聚 糖:聚集体的分 子量非常大（大 约为2108）， 其中含有透明质 酸、硫酸角质素 、硫酸软骨素、 连接蛋白、核心 蛋白和大量的寡 糖链。8六员环糖类似于吡喃，所以又称之为吡喃糖，而五员环糖六员环糖类似于吡喃，所以又称之为吡喃糖，而五员环糖类似于呋喃，称之为呋喃糖。类似于呋喃，称之为呋喃糖。环化单糖中氧化数最高的碳称为异头碳。在环式结构中，异头碳是手性碳，所以环化的醛糖或酮糖可以呈现两异头碳是手性碳，所以环化的醛糖或酮糖可以呈现两种异头构型中的一种，即种异头构型中的一种，即 - -或或 - -构型。构型。吡喃呋喃多糖组成-单糖9葡萄糖环状结构10椅式构象-D-葡萄糖 -D-葡萄糖n 11直链淀粉是葡萄糖以-1，4糖苷键结合成的链状化合物n 直链淀粉12纤维素13多糖的理化性质n旋光性 n硫酸蒽酮反应（620nm）n硫酸苯酚反应(490nm)n氨基己糖乙酰丙酮(525nm)n糖醛酸硫酸咔唑(520nm)14第二节 多糖的纯度测定 n（一）超离心法n（二）电泳法n（三）凝胶色谱法n（四）旋光法15第三节 多糖的分子量测定 n凝胶色谱法n粘度法n超离心法n高效液相色谱16凝胶层析法n凝胶层析法：将分子量不同 的蛋白质通过一定孔径的凝 胶固定相，由于各组分流经 体积的差异，使不同分子量 的组分得以分离。n最先淋出的是最大的分子。nKd = 0， Ve= V0 ；nKd = 1 ， Ve= V0+Vi ；n0Kd1，Ve=V0+KdVi 。17凝胶色谱法n方法：nSephadex G-200，多糖标准品n分部收集，硫酸-苯酚检测，分别求得洗脱 体积Ve， Ve与 1gM之间存在着线性关系 ，绘制标准曲线。n Ve=-KlogM+Cn将待测样品上柱，待测多糖Ve。n通过标准曲线求出待测多糖分子量。18粘度法、超离心法n粘度法：用已知结构相似的多糖决定K值（ K M2），然后测出待测多糖的特性粘 数 ，计算待测多糖的分子量。n超离心法：根据测得的沉降系数计算多糖 的平均分子量。19高效液相色谱法测定分子量及分布n色谱条件： 凝胶柱（分子量大小），示差折光检测器 。 n标准曲线：n 标准曲线：LogMW = a+b tRn MW为重均分子量，tR为保留时间n待测多糖分子量（GPC专用软件）：n 重均分子量 Mw=(RIiMi)/ RIinMi为供试品在保留时间ti 时的分子量，RIi在第i部分中 被洗脱物质的量（重量）。 20第四节、多糖的含量测定n比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、 硫酸苯酚法、蒽酮法）n生物测定法（肝素钠）n生色底物法（低分子量肝素钠）21乙酰丙酮法（elson-morgan ） 氨基己糖n原理：n氨基己糖在碱性条件下 加热，可与乙酰丙酮缩 合成吡咯衍生物，该衍 生物与对二甲氨基苯 甲醛反应，反应物呈红 色，于525nm测定吸 收度。22硫酸咔唑法测糖含量n硫酸咔唑法己糖醛酸测定n在浓硫酸中，己糖醛酸与咔 唑溶液反应生成的反应物呈 红色。n 520nm比色23硫酸苯酚法测定糖含量（总糖 ）n原理：多糖在浓硫酸作 用下水解成单糖，该单 糖在强酸性条件下，与 苯酚反应生成橙色衍生 物。n它在490nm处有最大吸 收，其吸光度与浓度呈 线性关系。24蒽酮法测定糖含量（总糖）n原理：多糖在浓硫酸中 水解后，进一步脱水生 产糠醛类衍生物，与蒽 酮作用形成蓝色化合物 ，620nm进行比色测 定。n特点：10-100g范围 内其颜色的深浅与糖含 量成正比。n灵敏度高。25生物测定法肝素测定n美国药典采用羊血浆法 。n即比较肝素标准品和供 试品延长血浆凝结时间 的作用来测定肝素的效 价。26生物测定法肝素测定方法n标准品稀释液的配制:精密量取标准品溶液，按高、中、 低剂量组（ ds1 、ds2、 ds3 ）用0.9%氯化钠溶液配成 三种浓度的稀释液，相邻两浓度的比值为1:0.7。n供试品稀释液的配制：按供试品的标示量或估计效价（ AT），照标准品溶液与稀释液的配制法配成高、中、低 （ dT1 、dT2、 dT3 ）三种浓度的稀释液。n各管凝结时间换算成对数，照生物检定统计法中的量反 应平行线测定法计算效价及实验误差。n可信限率（FL%）不得大于5%。27生色底物法原理肝素、低分子肝素n n当蛋白酶（Fa）从生色底物分裂出pNA时，发色 物的产生量与剩余的酶量成正比，与肝素效价成反比 。n405 nm测定。28生色底物nBz：苯甲酰，Pip：哌啶酰， Tos：甲苯磺酰； 对-硝基苯胺（pNA）。n酰胺分解法（amidolytic method）。n当蛋白酶从生色底物分裂出pNA时，发色物的产 生量与剩余的酶量成正比，与肝素效价成反比。 。n405 nm测定。29生色底物法n 抗Xa因子活性测定 n以溶液吸收度和浓度的 对数，照生物检定统计 法中量反应平行线测定 法计算出供试品的抗Xa 因子活性n 可信限率(FL%)不得 大于10%。 30第五节、多糖类药物的结构分析n单糖组成n糖苷键连接方式n糖苷键连接位置31（一）多糖组成单糖的分析n1、水解方法n（1）、完全酸水解法n（2）、部分酸水解、碱水解n（3）、乙酰解n（4）、甲醇解n（5）、酶降解n2、鉴定32（1）、完全酸水解法 n水解难易取决单糖性质及构型。n呋喃型戊聚糖较吡喃型己聚糖易 水解，型较型易水解。n已聚糖一般用1 mol/L硫酸， 70，8小时。n氨基葡聚糖为4 mol/L盐酸， 100 9小时。33n（2）、部分酸水解、碱水解n选择温和的条件水解多糖，使糖链中某 种类型的键特异性地打断。n（3）、乙酰解n多糖经过乙酰解反应（醋酐、冰醋酸） 可生成乙酰化单糖和寡糖34（4）、甲醇解n多糖链在80100条件下与无水甲醇反 应能将糖链变成组成单糖的甲基糖苷。n甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙 酰基衍生物，进行气相色谱分析。35（5）、酶降解n分为外切糖苷酶和内切糖苷酶。n外切糖苷酶：切下多糖非还原末端的一个 单糖，并对单糖组成和糖苷键有专一性要 求。n内切糖苷酶可水解糖链内部的糖苷键，释 放多糖链片断以利于结构分析。362、单糖的分离鉴定n气相色谱法n高效液相色谱法n气相色谱法与质谱分 析连用37气相色谱法n常用的衍生物有：n 三甲硅烷（TMS）衍生物n 三氟乙酰（TEA）衍生物n 乙酰（AC）衍生物n 甲基（Me）衍生物38二、糖苷键连接方式的测定n红外光谱糖苷键类型n确定吡喃糖糖苷键时，用红外光谱，在890cm-1 处有特征吸收者，示有-型糖苷键，在840cm-1 处有特征吸收者，示有-型糖苷键。n核磁共振谱糖苷键（型或型）。nH-NMR谱中的化学位移5.4 和 5.1 ，有两个 信号说明分子结构中的糖苷键为型，如有 4.53说明有型。39三、糖苷键连接位置的测定n（一）、高碘酸氧化、Smith 降解n（二）、甲基化反应产物分析n（三）、乙酰解后质谱分析40（一）高碘酸氧化、Smith降解n原理：n选择性的氧化降解反应，能够作用于多糖分子 中1，2二羟基和1，2，3三羟基，生成 过碘酸氧化产物；此产物用硼氢化钠还原后， 再用酸水解，生成相应的醛、甲酸。n室温下用稀无机酸水解还原产物。411，2连接的糖苷键n 1，2连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物 用硼氢化钠还原得到稳定的多羟基化合物 ，再用稀盐酸水解，得到甘油及甘油醛。n方程式：421，3连接的糖苷键n1，3连接的糖苷键与高碘酸不起反应，经还原 与水解后得到原来的单糖。n方程式：431，4连接的糖苷键n1，4连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物用硼 氢化钠还原，用稀盐酸水解得到最终产物为赤 藓醇和乙醇醛。441，6连接的糖苷键n 1，6连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物 用硼氢化钠还原得到稳定的多羟基化合物 ，再用稀盐酸水解，得到甘油及乙醇醛。45（二）甲基化反应产物分析n原理：多糖经甲基化试剂作用使 分子中的羟基甲基化，然后用甲 酸和三氟醋酸水解，以气相色谱 鉴定甲基化水解产物。n如多糖分子中带有支链，甲基化 水解后可生成二甲基单糖。46（三）乙酰化后质谱分析n原理：多糖经过乙酰化反应（醋酐、冰醋酸 ）生成乙酰化单糖和寡糖。n用氯仿抽提，蒸去氯仿，进行质谱分析。n分子离子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰单糖 碎片峰，表明有支链结构。47实例：右旋糖酐（dextran）n右旋糖酐，又称葡聚糖，是若干个葡萄糖脱水形成的 聚合物。n微生物多糖，也是第一个工业化的微生物多糖，是由 肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）发 酵产生的。n产物的分子量很大，经水解后，用不同浓度乙醇多定 分级沉淀，得到中、低、小分子量的右旋糖酐成品。n临床上使用的是平均分子量为1600024000， 3200042000和6400076000的右旋糖酐20、 右旋糖酐40和右旋糖酐70，它们均是用做代血浆。48一、结构与理化性质n右旋糖酐的结构：它主要由葡萄糖（ 16）-糖苷键连接而成，同时含有 (13)-和(14)-糖苷键连接形成的 分支结构。n右旋糖酐为白色无定形粉末，无臭、无味 ，易溶于热水。n右旋糖酐溶于水后形成有一定粘度的胶体 溶液，在乙醇等有机溶剂中不溶。49二、鉴别n右旋糖酐经碱性水解后产生葡萄糖， 葡萄糖可使Cu2+还原为红色氧化亚铜 沉淀。n操作方法：取本品0.2 g，加水5 ml 溶解后，加氢氧化钠试液2 ml与硫酸 铜试液数滴，加热后变成红棕色沉淀 。50三、检查n右旋糖酐的检查项目较多，其中氯化物、重 金属、干燥失重、炽灼残渣的检查参见中国 药典2000年版二部附录，此外还有氮、分子 量与分子量分布的检查。n氮:用发酵法制备右旋糖酐时，发酵滤液中存 在着微量蛋白质。51氮n取本品0.2 g，置50 ml凯氏烧瓶中，加硫酸1 ml，加热消化至供试品成黑色油状物，放冷， 加30%过氧化氢溶液2 ml，加热消化至溶液 澄清，冷却至20以下，加水10 ml，滴加管 中，再用水稀释至刻度，缓缓加碱性碘化汞钾 试液2 ml，随加随摇匀；如显色，与标准硫酸 铵溶液(每1 ml相当于10 g的N)1.4 ml加硫 酸0.5 ml用同一方法处理后颜色比较，不得更 深(0.007%