外源基因在酵母体系中的表达外源基因在酵母体系中的表达l 酵母菌是一种单细胞真核生物，人们对其 遗传学、生理学和全基因组序列等方面已有 较为深入的研究。酵母菌在分类学上属于真 菌界子囊菌纲和担子菌纲，目前已发现90多 个属，700多个种，10000多个独立菌株，构 成一个庞大的微生物家族。l酵母作为基因工程表达系统，既有原核生物 那样生长、繁殖快速，表达量高的特点，又 有与高等真核生物十分相像的蛋白质翻译后 加工和基因表达调控的特征。另一方面，长 期以来酵母作为工业微生物的主要菌种，在 工业化发酵方面已积累了大量的经验。因此 酵母表达系统是一种有着非常大的发展潜力 的真核生物基因表达系统。目前用于基因表达的酵母表达 系统主要类型有以下11种：l酿酒酵母表达系统l粟酒裂殖酵母表达系统l克鲁维酵母表达系统l毕赤酵母表达系统l汉逊酵母表达系统l解脂耶鲁酵母表达系统l假丝酵母表达系统l许旺酵母表达系统l嗜腺嘌呤阿祖鲁酵母表达系统 l丝孢酵母表达系统 l球拟酵母表达系统 l酵母附加体型载体(YEp)l酵母复制型载体(YRp)l酵母着丝粒型载体(YCp)l酵母线性载体(YLp)l酵母整合载体(YIp)l酵母人工染色体(YAC)酵母菌基因工程载体：酵母菌启动子类型l组成型l诱导型l分泌型l复合型l第一代酵母基因工程表达系统是以酿酒酵 母表达系统为典型代表。l第二代酵母基因工程表达系统的典型代表 就是近年来倍受关注的毕赤酵母表达系统 等为代表的甲醇酵母表达系统：1987年Cregg等首次报道甲醇营养型毕 赤酵母(Methy1otrophic Pichia pastoris)表达 外源蛋白以来，由于它具有表达效率高， 遗传稳定，产物可分泌表达等优点，己成 为近年来极受青睐的真核基因表达系统。l短短十多年来，用该系统表达的外源基 因已达三百多种，表达的产物包括细胞 因子、基因工程疫苗、基因工程抗体、 蛋白酶及受体等，表1为利用毕赤酵母表 达的活性蛋白，其中大部分可成为医药 制品，用发酵罐发酵规模可达20-50M3以 上。因此，毕赤酵母表达系统的研究进 展具有极重要的经济效益和社会意义。Tab.1 Published examples of heterologous protein expression in Pichia pastorisl在基因工程表达调控水平上，巴斯德毕 赤酵母（Pichia pastoris）基因表达系统 已有许多新进展。l载体类型的发展：毕赤酵母载体一般为穿 梭载体(Shutt1e Vector)，通常具有甲醇精确 诱导调控的醇氧化酶(Alcohol Oxidase ,AOX)启动子PAOX；根据酵母菌基因组上 AOX结构基因被外源基因所替换情况，形 成Mut+或Mut-等不同表型；载体含有一个多 克隆位点、AOX1转录终止序列、酵母选择 标志His4以及来自大肠杆菌质粒 pBR322的 Amp和ColE ori序列等。l遗传稳定性：毕赤酵母表达载体多采用 整合型表达质粒，以线形化重组质粒形 式整合到酵母基因组内，随着酵母宿主 菌染色体的复制而复制，外源目的基因 在酵母世系传代趋于稳定，不易丢失。l载体元件的发展：除了PAOX1启动子外，还有 PDAS、PGAP启动子等同样具有很高的表达效率 。l选择性标记：毕赤酵母一般为营养缺陷型筛选 ，常用His4，也有用蔗糖酶基因SUC2和G418r 、Zeocinr等。l信号肽序列：可用外源基因自身的信号 肽在毕赤酵母中表达，也可用来自酿酒 酵母交配因子（AMF）的信号肽序列（ pre-proAMF）等，达到分泌表达的目的 。此外，信号序列还可使用来自酿酒酵 母的SUC2信号肽序列，酵母酸性磷酸酶 基因PHO1的信号肽序列等。l目标蛋白降解：为了增加分泌蛋白的稳定 性，避免被宿主菌蛋白酶降解，一些研究 者使用蛋白酶缺陷型菌株。l提高毕赤酵母表达外源蛋白产量方面：虽 然外源基因在整合拷贝数上大多为单拷贝 整合，即可获得较高的产量，但提高拷贝 数也是研究提高表达量的重要方面。l在细胞代谢调节水平上，甲醇营养型毕赤 酵母的主要特征之一是能以甲醇作为唯一 碳源和能源。甲醇代谢的第一个酶是醇氧 化酶（Alcohol Oxidase, AOX），将甲醇氧 化为甲醛（Formaldehyde）。毕赤酵母宿 主菌有二种醇氧化酶基因，分别为AOX1和 AOX2，二者编码核酸序列有92的同源性 ，氨基酸序列有97的同源性。lAOX1在转录水平上受到严格的双重调控： 在碳源饥饿状态下，只有甲醇诱导AOX合 成后才能启动PAOX进行转录和翻译；在非甲 醇碳源条件下，通过基因重组插入在PAOX启 动子和终止子之间的外源基因维持在表达关 闭（SHUT-OFF）状态。巴斯德毕赤酵母另 一重要特征是在甲醇被醇氧化酶（AOX） 氧化为甲醛后有二条代谢途径：l途径之一甲醛被进一步氧化为甲酸后生成 CO2释放的完全氧化途径；途径之二与三 羧酸循环相耦合同化甲醛的木酮糖单磷酸 途径(Xylulose monophosphate pathway)。这 二条代谢途径都能为细胞生长提供能量和 成分物质。在甲醇诱导阶段酵母细胞生长 和外源蛋白表达都是由甲醇氧化提供能量 ，并且菌体生长和外源蛋白表达之间是相 互竞争的。l因此，巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白其 代谢流的合理分布是一个十分重要的问 题。在不同环境条件下对细胞代谢流的 定量分析可以使人们对细胞培养的基础 代谢有更好的认识，为甲醇营养型毕赤 酵母高密度高表达的发酵过程控制提供 坚实的理论基础。l此外，甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋 白时呈现明显的两相发酵：一为酵母细 胞生长阶段；一为诱导表达阶段。在各 阶段碳源都为限制性基质，其补加速率 的动力学模型是高效表达的又一基础性 研究。谢 谢 ！