1青霉素结合蛋白与细菌对_ 内酰胺抗生素的抗药性机理【论文关键词】青霉素结合蛋白金黄色葡萄球菌绿脓杆菌; 细菌细胞壁病原菌点结合大肠杆菌【论文摘要】-内酰胺抗生素(如青霉素类和头孢菌素类等 )可以专一性与细菌细胞膜上的靶位点结合,干扰细胞壁肽聚糖合成而导致细胞死亡。由于靶位点能与同位素标记的青霉素 G 进行共价结合, 因此将这些靶位点称之为青霉素结合蛋白(Penicillin binding pro-teins,PBPs)。一些革蓝氏阴性细菌和少数革蓝氏阳性菌能够产生多种 -内酰胺酶,这些酶可以水解青霉素和头孢菌素等抗生素 ,而使细胞具有抵抗这类 -内酰胺抗生素的杀伤能力。已经证明 -内酰胺酶产生与质粒和染色体基因有关。对于不产生 -内酰胺-内酸胺抗生素(如青霉素类和头抱菌素类等 )可以专一性与细菌细胞膜上的靶位点结合，干扰细胞壁肤聚糖合成而导致细胞死亡。由于靶位点能与同位素标记的青霉素 G 进行共价结合，因此将这些靶位点称之为青霉素结合蛋白(penieillinbindsng pro-teins，PBPs)。一些革蓝氏阴性细菌和少数革蓝氏阳性菌能够产生多种 一内酞胺酶，这些酶可以水解青霉素和头抱菌素等抗生素，2而使细胞具有抵抗这类 一内酞胺抗生素的杀伤能力。已经证明 一内酞胺酶产生与质粒和染色体基因有关。对于不产生庄内酞胺酶的细菌而言，获得刀一内酞胺抗性的能力是通过改变抗生素作用的靶位点，其结果或者减少 PBP5 的数量或者降低 PBPs 对药物的亲和力。这种不依赖刀一内酞胺酶而存在的庄内酞胺抗性广泛存在于人类病原菌中，而绝大多数这类病原菌是从经过刀一内酞胺药物治疗过的病人中分离出来的，如许多临床分离到的绿脓杆菌1 、金黄色葡萄球菌2-3 、流感嗜血杆菌(4-5)、肺炎链球菌(6-7)、淋球菌临(8-9)、屎链球菌(10-11)等均具有内在的 -内酚胺抗性。由于临床上越来越多地分离到月耐药性细菌，对于 一内酞胺抗生素的: 使用目困. 提出了挑战，有关细菌对 一内酞胺药物抗性机理的研究也就越来越多地引起人们的重视，这种研究对发展新一代抗生素更有效地用于临床治疗具有重要意义。本文主要介绍细菌内在的口一内酞胺抗性机理研究进展。一、PBpS 的生物学特性早在 1940 年 Gardner 在观察青霉素 G 对敏感细菌作用时发现细胞壁是 -内酞胺抗生素最初攻击的靶位点，因为青霉素 G 的作用首先是削弱细胞壁的功能。后来进一步证实庄内酸胺抗生素首先与细胞膜上的 PBP 产 S 结合，这些 PBPs 具有酶活性，参与细菌细胞壁肤聚糖的合成。肤聚糖主要负责维持细菌细胞壁的完整性，3生长在低渗环境中的细菌如该结构破坏会导致细胞死亡。 一内酞胺抗生素与 PBPS 结合，干扰了 PBPs 的正常酶功能，使细胞壁正常合成阻断。所有检测的真细菌种至少含有 3 种 PBPS，有些含有 8 一 9 种。有关 PBP 侣的命名后面将要介绍。对大肠杆菌的PBP 尹 S 研究得最清楚(12.13.14) 。在大肠杆菌中有 7 种 PBPS，依次为 PBPIA、IB 产 S、2、3 、4、5 、6。这 7 个 PBPS 分别受控于 10 个不同的染色体遗传位点。ponA 或 mrcA 决定PBPIA;ponB 或 mreB 控制 IBS;pbpA 或 mrdA 与PBP2 产生有关;pbpB 或 ftsl 编码 PBPs;dacB、dacA、dacC三个遗传位点分别控制 PBP4、5、6 。PBPIA 分子量92KDa，PBPIBC 由一系列分子量在 90KDa 范围的蛋白质组成。PBPIA 和 IB p 在体外兼具有转葡糖基酶和转肤基酶活性，这二种酶在细菌细胞壁合成中起重要作用，如果 PBPIA 和 IB;S 同时失活则导致细胞快速裂解死亡。PBP2 分子量为 66KDa，在间隔区(septa)细胞壁合成时具有转肤基酶活性，PBPZ 失活，细胞变成球形体不生长。PBP3 的分子量为 60KDa，在 IBgl 隔区横壁(eross 一 wall)合成时有转葡糖基酶或(和) 转肤基酶活性。PBP3 突变细胞变成无隔膜的丝状体。PBP4 分子量 49KDa，具有次级的转肤基酶、 D、D 一竣肤酶或 D、D 一内肤酶活性，在肤聚糖成熟中起作用。PBP4 变性导致细胞不能持续转肤作用。PBPS 和 6 均具有 D、D 一狡肤酶活性，目前尚未观察到对于这二个蛋白质变性引起的细菌生理生化4反应。除上述发现的 7 种 PBPS 外，用碘代青霉素衍生物又检测到一种新的 PBPs，命名为 PBPIC，有关大肠杆菌 PBPIC 的特点及功能还不清楚(15) 。同时抑制 PBP 工 A 与任何一种 PBPBS，PBPZ 或 PBP3均导致生长的大肠杆菌细胞死亡。所有这些高分子量 PBPS 均具有体外转肤基酶活性，除 PBP2 外，其它均具有转葡糖基酶活性，很明显，所有这些 PBPs 在大肠杆菌细胞壁或横壁合成的催化控制中起重要作用，它们是独立的刀一内酞胺抗生素杀伤靶位点。二、pBPS 分离及纯化每个大肠杆菌细胞约含 105104 个 PBPS 分子，共分成二类，一类为含量丰富的低分子量 PBP/s，具有 D、D 一拨肤酶活性，由于含量丰富，这类 PBPs 很容易纯化。第二类由一些含量较少的高分子量 PBPS 组成，纯化比较困难，而且纯化的 PBPs 在体外常常检测不到酶活性。早期用) 青霉素标记敏感细菌时发现，青霉素与细胞膜上少数高亲和力 PBPs 形成的复合物在 2%SDS、酚水溶液或沸水中可以保持稳定，而且既便有过剩的非标记 一内酞胺药物存在时也不与标记的青霉素发生取代。PBPs 能与青霉素衍生物进行共价结合5的特性使得人们能用亲和层析方法分离纯化这些蛋白质，洗脱剂用经胺，因为经胺是转肤基作用的受体，用这种方法可以纯化活性pBPSSpratt 和 Pardee(16)发明一种简单可重复性技术用于PBPs 分离。首先用一青霉素标记膜制备物，并使之饱和，然后用离子去污剂使之变性(主要防止青霉素一 PBP 复合物被酶水解)。用 SDS 聚丙烯酷胺凝胶电泳分离各 PBP 产 s，根据分子量的递减或者在 SDS 一中泳动速率递增命名为，PBPI、2n 。各种细菌的PBPs 均用此法命名，亚类可用 A、B 、C 等。如 PBPI 又分为PBP 一 A、1B 和 1C。在膜制备过程中有必要保留 PBPs 活性。需要说明的是，其它的 一内酞胺抗生素如甲氧西林 (methieillim)、头抱西丁(Cef-oxitin)、氨苇青霉素以及 moxalaetan 等也可与膜蛋白结合，但所有的 一内酸胺抗生素的靶位点均位于 PBP/s 之间，尚未发现一种只与上述抗生素结合而不与青霉素结合的膜蛋白。另外实验表明，在分离 PBPs 时，用一青霉素进行体外标记比升青霉素专一性更高。三、革蓝氏阳性细菌 PBPS 改变与细菌内在 一内酞胺抗性关系6一般讲，革蓝氏阳性细菌细胞壁可自由透过 一内酞胺抗生素，除产生 一内酞胺酶菌株，革蓝氏阳性菌一般对青霉素敏感。目前产生 一内酞胺酶的菌株在革蓝氏阳性菌中主要是葡萄球菌，几乎所有的金黄色葡萄球菌都产生 一内酞胺酶。由于葡萄球菌产生 -内酞胺酶，临床上曾采用甲氧西林取代青霉素，但使用不久就分离到抗甲氧西林的突变株。从英国、美国、意大利、澳大利亚、日本等国分离到的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌突变株均发现含有一个共同的但在正常敏感菌株中不存在的 PBP，命名为 PBP2 (或PBP2a)(17)，分子量约 7sKD。 ，该蛋白质对广谱房内酞胺抗生素均具有较低的亲和力。该 PBPZ在 SDS 一 page 中位于野生型PBPZ 和 3 之间。Brown 和 Reyoolds(18)研究表明，金黄色葡萄球菌表达甲氧西林抗性受生长条件的影响。在较低温度(30)或高渗透压培养基中抗性增加，在低 pH 值培养基中抗性降低。菌株 13136p 一m+在 30对所有的庄内酞胺抗生素均有抗性，但在 40则表现正常的敏感型。在 30培养时，细胞膜中出现大量的 PBP2，而40生长的细胞则缺少这种 PBP2。因此， Brown 提出，当其它的FBPs 失活后，这种新的低亲和力 PBP 取代了其它 PBPs 的功能。PBF2存在于所有的已检测的抗甲氧西林菌株中。除在葡萄球菌中观察到 PBPs 改变外，在其它抗性菌株中也发现，如抗邻氯青霉素(Cloxacillin)枯草芽抱杆菌，相应的 PBP2a 对该种抗生素的亲和7力降低。在临床分离到的青霉素抗性产气英膜梭菌突变株则降低PBPI 对青霉素的亲和力。因此，在不同的革蓝氏阳性菌中， 一内酞胺抗生素与不同的 PBPs 亲和力也不同。而有些细菌表达这种内在的 一内酸胺抗性机理要复杂得多。例如肺炎链球菌，该菌不产生庄内酸胺酶。用 SDS 聚丙烯酸胺凝胶电泳分离肺炎球菌 PBPs 时发现敏感型肺炎球菌有 5 种青霉素结合蛋白PBPla、lb 、2a 、2b 和 3。用同样方法检测耐青霉素菌株的 PBP 产s 发现相应的 PBPs 的生化特性和对青霉素的亲和力均有所改变。耐青霉素菌株的 PBPla 和 1b 完全丧失与青霉素的亲和力，出现一种新的分子量较小的 PBPlc。另外耐药菌株的 2b 也被一种新的分子量接近于 2a 的 PBP2a 产所代替。为进一步研究 PBPs 与抗药性之间的关系。Zighelboim 等田分离野生型耐青霉素肺炎球菌8249DNA 转化敏感型肺炎球菌受体菌 R6。经多次转化获得一系列耐药水平不同的转化子，转化结果说明，菌株 8249 的高耐药(对青霉素)特征不能通过一次转化传给 R6。而需要进行多次转化才能使R。逐渐获得较高的抗性性状。Shoekley 等20以及其它的研究者对肺炎球菌耐药机理研究也得出相同的结果。目前对于肺炎球菌有多少遗传因子与抗药性有关还不清楚，但多重转化实验逐步获得高水平耐药性转化子说明野生型菌株 8249 携带有多重突变的遗传因子，抗药性是受多基因控制，那么受体菌需要吸收多个 DNA 分子以满足细胞获得高水平抗性的需要。这种需要多次转化逐步获得较高的抗性水平的现象在金黄色葡萄球菌中也得到证实(17)。8从上述研究不难看出，在革蓝氏阳性细菌抗性菌株中新出现的低亲和力 PBPs 阻止了 内酞胺抗生素对细胞的抑制作用，当其它的 PBPs 由于抗生素结合而失去活性时，这些低亲和力 PBPs 可以补偿其它 PBPs 的功能。另外，在抗性菌株中，相应的 PBPs 从高抗生素亲和力向低亲和力方向改变，肺炎链球菌 PBPs 改变是说明这类问题最好的例子。四、革蓝氏阴性细菌 PBPs 改变与细菌内在 一内耽胺抗性关系革蓝氏阴性细菌的外膜穿透能力变化较大，一般在奈瑟氏菌中较高，在假单抱菌中较低，而肠道菌处于中间水平。多数革蓝氏阴性细菌产生介内酞胺酶，这些酶能水解青霉素类、头抱菌素类等类抗生素。现已发现绝大多数肠道菌、25%的流感嗜血杆菌、拟杆菌、假单胞菌、淋球菌、粘膜炎布兰汉氏球菌均产生庄内酞胺酶。对不产生 -内酞胺酶但具有青霉素抗性的淋球菌分析表明，有 6 个遗传位点 PenA、mtr、penB 、peln、tem、env 控制菌株内在的庄内酞胺抗性20， “。penA 基因专一性决定低水平青霉素抗性，mtl基因本身除增加对青霉素抗性外还与其它的抗生素抗性有关，tem 和 pen 基因本身没有可表达的性状，但转化实验证明，这二个基因携同其它三个基因一道可以提高菌株对青霉素的抗性，env 基因突变则削弱青霉素抗性表达。9Dougherty 等发现，青霉素抗性淋球菌首先降低 PBPZ 对青霉素的亲和