哺乳动物胚胎工程 Mammal Embryo Engineering 第一节、胚胎移植 （Embryo Transplant）定义：将良种母畜配种后的早期胚 胎取出，移植到同种、生理状态相同的其 他母畜体内，使之继续发育成为新个体。 一、概述提供胚胎的母畜称为供体（Donor）接受胚胎的母畜称为受体（Recipient） 二、胚胎移植的过程及意义1、充分发挥良种母畜的繁殖潜力。2、加速品种改良，扩大良种畜群。3、诱产双胎，提高生产效率。4、防疫需要和克服不孕。5、基础研究手段。6、满足畜牧业现代化的需要。1、遗传物质来自亲代。2、营养物质来自受体。 三、胚胎移植的特点 四、胚胎移植的生理学基础和原则1、母畜发情后生殖器官的孕向发育；2、早期胚胎呈游离状态；3、胚胎移植基本上不存在免疫问题；4、胚胎与供受体的关系。 (一)生理学基础(二)胚胎移植的基本原则1、胚胎移植前后所处环境的一致性。种属的一致性；生理的一致性； 收集和移植部位的一致性。 2、胚胎发育的期限不超过周期黄体的寿命。通常是在供体发情配种后3-8天内收集胚胎。3、胚胎的质量0-2d1-3d2-3d3-5d4-5d5-6d5-7d7-8d7-9d8-10d9-11d 五、胚胎移植的技术过程供受体的选择；供体的超排处理与配种和受体的同期发情；胚胎的收集；胚胎的检查；胚胎移植。牛胚胎移植示意图Boer胚胎移植示意图优良公Boer羊供体母Boer羊超排手术取胚受体母山羊同期发情后代(一)供体和受体的选择供体：良种母畜。 受体：良好的繁殖性能，健康、体况中上等。(二)供体超数排卵处理和受体 母畜的同期发情1、超排目的得到足够量的合格胚胎。2、超排方法（发情911天） FSHPG法牛超数排卵早：FSH1.5mg； 晚：FSH1.5mg早：FSH1.0mg；晚：FSH1.0mg早：FSH0.6mg+PGF20.4mg；晚：FSH0.6mg早：FSH0.4mg；晚：FSH0.4mg发情后配种或输精两次，每隔6h输一次(为0d)第67d冲洗子宫：盐酸利多卡因尾椎麻醉桑椹胚早期囊胚PMSG法牛超数排卵发情第1617d，注射PMSG15003000IU隔日注射 hCG10001500IU2448h发情，配种或输精（为第0d）第67d冲洗子宫，获得桑椹胚早期囊胚FSHPG法羊超数排卵早：FSH（国产，7.5mg/瓶）；晚：FSH早：FSH；晚：FSH早：FSH + PGF22ml ；晚：FSH2448h发情，配种或输精两次（为第0d）发情周期第1213d（绵羊）、1618d（山羊）第6d冲洗子宫，获得桑椹胚早期囊胚同时静脉注射LH100150IU*国产FSH总量为150 300IU（一）PMSG法羊超数排卵发情周期的 1213d（绵羊）、 第16 18d（山羊）注射PMSG8001500IU2448h发情，配种或输精（为第0d）同时注射hCG500750IU第6d冲洗子宫，获得桑椹胚早期囊胚（二）PMSG法小鼠超数排 卵注射PMSG1020IU48小时后注射hCG1020IU，公母合笼24小时后刺破输卵管，获得早期受精卵3、受体母畜的同期发情与供体母畜超排同时进行。P4、PGF2a (三)供体母畜的配种要求：1、优良公畜的精液；2、精子活率高、密度大且两次配种。同期发情与超排程序放栓发情鉴定 配种0-9101112131 41 51 61 71 81 9207:00 FSH 4ml 18:00 FSH 4 ml7:00 FSH 2.5ml 18:00 FSH 2.5ml7:00 FSH 2ml 14:00 PG6ml 18:00 FSH 2ml7:00 FSH 1.5ml 14:00 取栓 18:00 FSH 1.5ml配 种配 种检 查 黄 体冲 胚 移 胚(四)胚胎的收集1、手术法收集胚胎手术 优点：冲卵比较彻底缺点：手术对动物剌激性大从子宫角顶端冲洗输 卵管：牛、羊、兔胚胎在输卵管中从输卵管伞处冲洗输卵管：猪、马胚胎在输卵管中胚胎在子宫角时从子宫角上端向基部冲洗2、非手术法收集胚胎优点：对动物损伤小， 缺点：冲卵不彻底，需要冲卵液多非 手 术 法 收 集 胚 胎(五)胚胎的检查第6天收集的胚胎（未拣）1、检胚二细胞至四细胞胚胎2、胚胎鉴定荧光活体染色体醋酸荧光素（FDA，fluoresceindiacetate），培 养3-6，活胚胎显示荧光，死胎无荧光。测定代谢活性法1h测定葡萄糖的消耗量2-5g以上。 形态学法原核8细胞正常胚胎桑椹胚早期囊胚异常胚胎示意图未受精卵未受精卵 胞质中有空泡卵裂球脱落卵裂球分散卵裂球不规则受精卵退化透明带破裂透明带不规则卵圆形透明带 胚胎的移植手术法：各种家畜非手术法：牛、马(七)供体和受体的观察 健康状况； 是否发情。 六、胚胎移植目前存在的问题和 发展前景。1、超排效果不够稳定。2、胚胎回收率低。3、移植成功率低50-60%.(一) 问题(二)发展前景1、提高稳定超排效果。 2、改进非手术法收集和移植胚胎的技术和器具.3、胚胎移植技术应与胚胎切割、胚胎冷冻、早期胚胎的性别鉴定等结合起来。第二节 胚胎冷冻与体外受精(一)意义 1、建立胚胎库，保存优良种畜与濒危动物资源。2、使胚胎移植不受时间与地点的限制。3、胚胎运输取代种畜引进。 一、胚胎冷冻(二)冷冻原理形成冰晶胞外水分渗透压升高细胞脱水、 蛋白质变性胞内水分形成大的冰晶细胞死亡胞外溶液效应抗冻保护剂胞内形成大的冰晶胞外溶液效应冷冻保护剂：甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇。(三)冷冻及解冻方法1、缓慢降温法以低于0.2-0.8/min速度降低到70再投入液氮，解冻速度也不超过25/min 优点：脱水完全，细胞内不易形成冰晶 缺点：费时，需要特殊仪器2、快速冷冻，快速解冻胚胎采集洗涤加1.4mol/L甘油中平衡20装管0平衡 10以1/分降 至 - 6 -7 并平衡10以0.3-0.5/min 降至-35-38 后投入液氮。投入37水中 解冻1，然后 用0.20M蔗糖 PBS液洗2次 。3、一步冷冻法采用25%的甘油、丙二醇、乙二醇中的任何两种保护剂组成高浓度的玻璃化液，分两步移入低、高浓度的保护剂中，装管并在4平衡10然后投入液氮。（DMSO对胚胎的毒性很大） 2525%甘油13 25%甘油、0.25M蔗糖104 25%甘油、25%丙二醇30液氮 解冻：胚胎25水温0.5mol/L蔗糖5保存液冲洗3-4装枪移植。 二、体外受精(一)卵母细胞体外成熟1、采卵：剖腹、腹腔镜、屠宰场卵子分四类形态正常，卵丘细胞致密卵丘细胞部分脱落卵丘细胞全部脱落：裸卵卵子已退化2、未成熟卵子的培养 TCM-199+胎牛血清+丙酮酸，可加cAMP、 血清、生长因子、生殖激素(FSH、17-雌二醇 ，hCG)39 5%CO2饱和湿度20-30h M199+PMSG10/ml+hCG10/ml17-雌二醇1mg/L10%猪卵泡液 10%FSC+半胱氨酸69mg/L培养成熟牛卵母细胞(二)精子体外获能1、精子洗涤：多次离心2、精子获能BO液咖啡因，肝素、BSA、钙离子载体改良Tyrode10mg/ml肝素(三)体外受精 微滴：5-10个卵母细胞加0.64-1106/ml精子395%CO2气体Tyride18-24h BO 6-8h液滴示意图卵母细胞质成熟：细胞质成熟较难鉴定，因此，通常只检查细胞核的成熟。卵母细胞核染色制片：压片。固定：固定液 乙醇：乙酸3：1，24h染色：1地衣红，40乙酸镜检：光学显微镜制片、固定、染色示意图(四)早期胚胎的体外发育培养 许多动物早期胚胎均存在体外发育阻滞 现象。 M199+0.875g/L牛磺酸 6%mg/L半胱氨酸5% CO2(五)精子显微注射 指采用显微操作方法将处理后的精子核或 完整的精子直接注入卵质，完成受精过程 。 细胞流式分类器 基本程序：精子注射前处理：精子核。借 助显微操作仪将核直接穿过透明带和卵膜进入 卵质中；注射后的卵母细胞体外培养。胞质内授精（ICSI）带下授精第三节 胚胎显微操作显微操作仪分割徒手分割0.1-0.2%链霉蛋白酶软化透明带 一、胚胎分割胚胎分割二、细胞核移植 单个卵裂球或体细胞核，移入去核的成熟卵 母细胞中采用一定的方法激活卵母细胞，使供体核和受体核融合为重构胚，经移植后发 育成新个体的技术。 “多莉”doly核移植的程序图克隆技术路线图“多莉”doly显微注射仪显微注射仪操作臂显微注射仪操作臂显微注射仪操作臂拉针仪煅烧仪磨针仪核移植技术的操作过程 供体核的分离技术a、胚细胞胚胎干细胞 类胚胎干细胞b、体细胞 受体细胞的去核技术a、受精卵：松弛素b、成熟卵母细胞 核卵重组技术：移入供体核 卵母细胞的激活与细胞融合 核移植胚的培养与移植或重复克隆技术。三、转基因动物是指将外源基因通过显微操作，整合到某种动物的基因组中，并使之在转录及翻译的水平上得以表达，从而改变该物种的生物学特性。转 基 因 动 物 的 制 备 转基因的意义 提高家畜的经济性状， 以家畜为畜主生产有用的生物活性物质， 抗病育种， 利用转基因猪生产人类所需的器官。转基因动物制备过程 基因导入方法1、显微注射转基因小鼠制备过程逆转录病毒感染法 胚胎干细胞介导法 精子载体法第四节性别控制技术沉淀法X精子体积较大，沉淀快梯度离心法X、Y精子DNA含量有差异的原理，X较Y大电泳法X、Y精子表面所带电荷的差异靠近正极X、负极Y一、精子分离方法H-Y抗原法抗H-Y的抗体处理精子，使Y精子失能精子的柱层析分离法 葡聚糖凝胶G-50X精子的DNA含量略多干Y精子速度慢，受胎率较低，价格昂贵。 流式细胞分类器二、胚胎的性别控制细胞遗传学核型分析X染色体连锁酶活力测定法雌性胚胎X染色体连锁酶的活性是雄 性的两倍。H-Y抗原法 细胞毒性分析法含有H-Y抗血清与补体的培养液中培养，有H- Y抗原的胚胎表现出一定的细胞溶解。 间接免疫荧光法先将8细胞至囊胚期胚胎与H-Y抗体反应30分钟 ，与FITC标记的IgM抗体反应。然后在荧光显微 镜下检查胚胎是否带有荧光素，若有为雄性。Y染色体特异性DNA探针法用同位素标记的Y染色体特异序列的探针，用这一探针与从胚胎细胞中提取的少量DNA杂交。在雄性的DNA片断，即SRY（性别决定区） 与PCR扩增技术相结合，用于胚胎性别鉴定。三、外界环境控制饲养类型及营养水平 谷物饲料为主的酸性饲料类型多雄性后代 青绿饲料为主的饲料类型多雌性后代 营养不良时多雄性后代 营养丰富时多雌性后代控制配制年龄过于年老的或过于年轻的母体常多生雄性;中年常多生雌性。交配特点 交配次数雄兔于一天中进行多次交配，发现后代中的 雌性越来越多。 受孕时间发情早期卵子刚排出时受孕后代雌性较多， 发情晚期卵子过度成熟后受孕者雄性多。 人工授精时所采用的一些其他方法在输精前20-30, 精氨酸阴道内注入1ml：高、 低雄，中雌复习思考题名词解释：胚胎移植、细胞核移植、转基 因动物、精子显微注射 、胚胎冷冻 胚胎移植的意义。 胚胎移植的生理学基础。胚胎移植的基本原则。 胚胎移植的技术过程。胚胎移植目前存在的问题和发展前景。 胚胎冷冻的原理。性别控制有哪些技术？