实验四 蛋白酶活力的测定(先打开水浴锅，温度设置成40C)n一、实验目的n二、实验原理 n三、器材仪器和主要试剂n四、实验操作n五、思考题n六、值日一、实验目的n掌握定量测定蛋白酶活性的方法，了解本实验的酶、底 物和生成物的相关性，以及本反应的环境条件。n进一步理解酶活力和比活力的概念n巩固比色法测定物质含量的基础，掌握分光光度计使用 方法，学习绘制标准曲线的方法二、实验原理1胰蛋白酶是一种水解酶，将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。2所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质。酚试剂又名Folin试剂，是磷钨 酸和磷钼酸的混合物，在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝 色（钼蓝和钨蓝的混合物，680nm）。3用分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含 量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。4. 蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下，反应10min，以每min水 解酪蛋白产生1 g酪氨酸为1U。三、器材仪器和主要试剂 n可见光分光光度计 n水浴锅nFolin 酚试剂n 0.5% 酪蛋白 n100 g/ml Tyr 溶液n三氯氯醋酸nNa2CO3n胰蛋白酶四、实验操作 1、酪氨酸标准曲线的制作管号123456样样品、对对 照滤滤液（ 各2支试试管 ）100g/ml Tyr (ml)00.20.40.60.81.0每支管加 1ml水（ml)1.00.80.60.40.20稀释释后Tyr浓浓度（g/ml ）020406080100Na2CO3 (ml)5555555Folin-酚试剂试剂 (ml)1111111迅速混合，于40放置15分钟钟 A680nm调调0 A样样、A 对对照以酪氨酸的浓度（g/ml）为 横坐标， A680nm为纵坐标，作 出标准曲线。 管号酶液（ml ）酪蛋白（ ml）三氯氯 醋酸（ml ）40水浴准确保 温10分钟钟三氯氯 醋酸（ml ）酪蛋白（ ml）40水浴保温10 分钟钟，过滤过滤 得滤滤 液 样样品管12-3-对对照管1-3-22、蛋白酶活力的测定n按下表操作，然后测定滤液中的酪氨酸含量。n滤液各取1ml，进行显色反应(加Na2CO35ml+Folin-酚试剂1ml ，40 C保温15min)n以标准曲线中的1号管调0，测定A 样 (样品液A680nm值)和A 对 (对照液A680nm值)；管号酶液（ ml）酪蛋白 （ml）三氯氯 醋酸（ ml）40水 浴准确 保温10 分钟钟三氯氯 醋酸（ ml）酪蛋白 （ml）40水浴保温 10分钟钟，过过 滤滤得滤滤液。 1 号 (样样品)12-3-2 号( 对对照)1-3-23. 酶活力计算n胰酶活力定义： 40 ， pH7.5 ，反应10min，每分 钟水解酪蛋白产生酪氨酸 1 微克为一个酶活力单位。 计算：1g 蛋白酶所具备的总活力单位为：( A 样 - A 对) K V/t N A 样 ：样品液光吸收值； A 对 ：对照液光吸收值； K ：标准曲线上A680nm为 1 时的酪氨酸微克数； t ：酶促反应的时间（min），本实验 t =10min ； V ：酶促反应管的总体积（ml数），本实验 V =6 ； N ：本次实验酶液的稀释倍数:6000五、思考题n酶的试验为何设对照又要设空白?n稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原因。n计算公式中的v=6该如何理解n本实验用什么方法终止酶促反应?还有其他方法 可以终止反应吗?n如何保证本实验测定数据的准确性？n胰蛋白酶的比活力如何计算？六、值日n请将实验废水倒入废水缸，将试管清洗干净，不要留下 蓝色痕迹.n值日第11+12组.