探讨小麦硫转运蛋白基因探讨小麦硫转运蛋白基因RTRT -PCR-PCR半定量检测体系的建半定量检测体系的建 立立摘要摘要摘摘 要要 应用应用RT-PCRRT-PCR技术，技术， 以以TubulinTubulin为内参为内参 基因，小麦硫转运蛋白基因基因，小麦硫转运蛋白基因(Sul)(Sul)为检测基为检测基 因，优化因，优化Mg2+Mg2+浓度、退火温度、循环次数浓度、退火温度、循环次数 、引物浓度和、引物浓度和TaqTaq酶浓度，获得适宜的酶浓度，获得适宜的PCRPCR 反应参数，建立一个相对稳定、准确、特反应参数，建立一个相对稳定、准确、特 异的检测异的检测SulSul表达量的半定量体系，为进一表达量的半定量体系，为进一 步研究小麦硫转运蛋白表达调节机制奠定步研究小麦硫转运蛋白表达调节机制奠定 技术基础。技术基础。引引 言言硫转运蛋白即硫酸盐转运蛋白，是一类硫转运蛋白即硫酸盐转运蛋白，是一类 主动运输硫酸根时所需的载体蛋白，也是植主动运输硫酸根时所需的载体蛋白，也是植 物体吸收、运输硫元素时的必需蛋白。硫元物体吸收、运输硫元素时的必需蛋白。硫元 素是植物生长发育所必需的基本元素之一，素是植物生长发育所必需的基本元素之一， 它主要以它主要以SO42-SO42- 形式被植物吸收，通过硫转形式被植物吸收，通过硫转 运蛋白进入植物体后，大部分同化为含硫氨运蛋白进入植物体后，大部分同化为含硫氨 基酸（如胱氨酸，半胱氨酸和蛋氨酸）和辅基酸（如胱氨酸，半胱氨酸和蛋氨酸）和辅 酶酶AA硫胺素、生物素等维生素。因此硫转硫胺素、生物素等维生素。因此硫转 运蛋白植物原生质构成、能量固定、光合作运蛋白植物原生质构成、能量固定、光合作 用、固氮作用提高植物抗逆性等方面起到非用、固氮作用提高植物抗逆性等方面起到非 常重要的作用。常重要的作用。 近年来，由于农业生产的提高增加了近年来，由于农业生产的提高增加了 单位面积上养分的输出，不含硫或含硫少单位面积上养分的输出，不含硫或含硫少 的肥料的使用量增加，作物秸秆还田少或的肥料的使用量增加，作物秸秆还田少或 作其他用途，导致土壤缺硫现象越来越严作其他用途，导致土壤缺硫现象越来越严 重。硫缺乏已成为很多地区限制农业生产重。硫缺乏已成为很多地区限制农业生产 的重要因素之一，因而研究硫转运蛋白对的重要因素之一，因而研究硫转运蛋白对 提高小麦吸硫效率提高小麦吸硫效率 提高小麦品质与产量提高小麦品质与产量 有着非常重要的意义。有着非常重要的意义。 为了进一步探讨硫转运蛋白基因调控为了进一步探讨硫转运蛋白基因调控 机制，有必要建立一种灵敏，简便，特异机制，有必要建立一种灵敏，简便，特异 的半定量检测的半定量检测Sul mRNASul mRNA表达的方法。逆转表达的方法。逆转 录多聚合酶链式反应录多聚合酶链式反应(RT(RTRCR)RCR)技术法是近技术法是近 年来发展出来的探讨基因转录水平的有效年来发展出来的探讨基因转录水平的有效 手段。手段。 因此本实验采用小麦为供试材料，以因此本实验采用小麦为供试材料，以 TubulinTubulin为内参基因，为内参基因，SulSul为检测基因，应为检测基因，应 用用RT-PCRRT-PCR技术对小麦根部硫转运蛋白基因技术对小麦根部硫转运蛋白基因 的表达进行半定量，建立一个特异、稳定的表达进行半定量，建立一个特异、稳定 的的RT-PCRRT-PCR半定量检测体系，为进一步研究半定量检测体系，为进一步研究 其表达调节机制奠定基础。其表达调节机制奠定基础。一、材料与方法一、材料与方法（一）实验材料（一）实验材料采用郑引采用郑引1 1号小麦号小麦。 （二）主要试剂（二）主要试剂1 1、主要试剂、主要试剂 HoglandHogland营养液，营养液，TrizolTrizol， M-MLVM-MLV反反 转录酶转录酶,Taq,Taq酶和酶和PCRPCR其他相关试剂，其他相关试剂，DNADNA回回 收纯化试剂盒，收纯化试剂盒，0.5TBE0.5TBE，琼脂糖。，琼脂糖。 2 2引物引物 （1 1）TubulinTubulin引物：引物：根据根据NemotoNemoto等设计的等设计的 扩增小麦扩增小麦TubulinTubulin基因片段的引物合成了上基因片段的引物合成了上 游引物游引物和下游引物和下游引物。 （2 2）SulSul引物：引物：根据小麦硫转运蛋白基因根据小麦硫转运蛋白基因 序列序列TAE512817TAE512817分别自行设计和合成上游引分别自行设计和合成上游引 物物和下游引物和下游引物。 （3 3）反转录引物：）反转录引物：Oligo-dOligo-d（T T）。）。（三）主要仪器（三）主要仪器Eppendorf 5415DEppendorf 5415D型离心机，型离心机，RT-200RT-200型型 PCRPCR扩增仪，扩增仪，DYYDYY型稳压稳流电泳仪（北型稳压稳流电泳仪（北 京六一仪器厂），京六一仪器厂），UVIUVI凝胶成像系统凝胶成像系统 （四）实验方法（四）实验方法1 1材料准备材料准备小麦种子用小麦种子用5% NaClO5% NaClO消毒消毒10min10min，吸胀，吸胀 24h24h，萌发，萌发48h48h后，在完全后，在完全HoglandHogland营养液中营养液中 光照培养至光照培养至3 3叶期。叶期。 2 2总总RNARNA提取提取 取小麦根取小麦根0.1g0.1g，置液氮迅速研磨，加，置液氮迅速研磨，加 Trizol 1000Trizol 1000 l l，室温静置，室温静置5min5min。加氯仿。加氯仿 200200 l l剧烈混匀，剧烈混匀，44下下12000g 12000g 离心离心15min15min。吸。吸 取上层水相加取上层水相加400400 l l异丙醇，混匀室温静置异丙醇，混匀室温静置 10min10min，44下下12000g 12000g 离心离心10min10min。小心弃上清。小心弃上清 ，沿管壁加，沿管壁加7575乙醇乙醇10001000 l l洗涤管壁。加洗涤管壁。加7575 乙醇乙醇10001000 l l涡悬，涡悬，44下下8000g8000g离心离心10min10min。小。小 心弃上清，短暂离心，吸取所有上清，沉淀于心弃上清，短暂离心，吸取所有上清，沉淀于 超净台下干燥，加超净台下干燥，加2020 l DEPC H2Ol DEPC H2O溶解。溶解。 取取5 5 l l 总总RNARNA稀释稀释100100倍，测倍，测ODOD值，检验其值，检验其 纯度。取纯度。取5 5 l l 总总RNARNA进行进行 1.01.0琼脂糖凝胶电琼脂糖凝胶电 泳，检测泳，检测RNARNA的完整性。的完整性。 3 3反转录反转录反应体系为反应体系为2020 l l，含总，含总RNA 2RNA 2 g g。 分分 别取别取5 5 l Oligo-dl Oligo-d（T T）（）（100mg/L100mg/L），总），总 RNA 3.64RNA 3.64 l l（见表（见表1 1）H2O 3.36H2O 3.36 l l ，7070 水浴水浴10min10min，冰骤冷，冰骤冷5min5min。加。加5Buffer 5Buffer 4 4 l l，dNTP 2dNTP 2 l l，RNasin 1RNasin 1 l l，M-MLV 1M-MLV 1 l l ，3737反应反应1h1h，95 5mim95 5mim中止反应。中止反应。 4 4PCRPCR扩增扩增参照标准参照标准PCRPCR反应体系，优化反应体系，优化Mg2+Mg2+ 浓度浓度退火温度退火温度模板浓度模板浓度循环次数循环次数 引物浓度和引物浓度和TaqTaq酶浓度，获得适宜的实验参酶浓度，获得适宜的实验参 数，建立半定量数，建立半定量PCRPCR检测体系。检测体系。 5 5PCRPCR产物的鉴定产物的鉴定PCRPCR扩增产物在扩增产物在0.5TBE0.5TBE缓冲液中用缓冲液中用 1.01.0琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色 ，电压，电压60v60v，电泳，电泳40min40min，在紫外灯下观察，在紫外灯下观察 电泳结果并切下特异电泳结果并切下特异DNADNA片段，用天为时代片段，用天为时代 DNADNA回收纯化试剂盒进行回收，送上海生工回收纯化试剂盒进行回收，送上海生工 公司测序。公司测序。 二、结果与分析二、结果与分析 （一）小麦根系总（一）小麦根系总RNARNA提取结果提取结果所提取的所提取的RNARNA在在0.5TBE0.5TBE缓冲液中经缓冲液中经 1.01.0琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1 1， 跑出三条清晰可见的带，分别为跑出三条清晰可见的带，分别为 28s18s5sRNA28s18s5sRNA，说明所提总，说明所提总RNARNA完整性完整性 良好，降解少。良好，降解少。28s rRNA28s rRNA 18s rRNA18s rRNA5s 5s rRNArRNA RNA RNA稀释稀释100100倍后用倍后用EppendorfEppendorf紫外分光紫外分光 光度计测得的光度计测得的ODOD值见表值见表1 1，A260/A280A260/A280的平的平 均值在均值在1.8-2.21.8-2.2之间，之间，A260/A230A260/A230也大于也大于 2.0, 2.0, 说明所提总说明所提总RNARNA没有蛋白、多糖及酚没有蛋白、多糖及酚 类等的污染，具有高纯度，达到试验要求类等的污染，具有高纯度，达到试验要求 （实验数据见表一）。按照此浓度计算出（实验数据见表一）。按照此浓度计算出 原管总原管总RNARNA浓度，约为浓度，约为2.0872.087 g/g/ l l。表表1. 1. 小麦根系总小麦根系总RNARNA纯度和含量的测定纯度和含量的测定浓度浓度 g/ml g/ml A260/AA260/A 280 280 A260/AA260/A 230 230 A230 A230 A260 A260 A280 A280 A320 A320 样品样品1 1 样品样品2 2 样品样品3 3 平均值平均值20.8 20.8 20.620.6 21.221.2 20.8720.872.00 2.00 2.012.01 1.981.98 2.002.002.32 2.32 2.352.35 2.112.11 2.262.260.224 0.224 0.2200.220 0.2510.251 0.2320.2320.520 0.520 0.5160.516 0.5300.530 0.5220.5220.027 0.027 0.0250.025 0.0250.025 0.0260.0260.000 0.000 0.0000.000 0.0010.001 0.0000.000（二）（二）PCRPCR反应体系的建立反应体系的建立 1. 1. 引物浓度的选择引物浓度的选择 PCRPCR扩增中引物浓度必须适宜，引物浓度过扩增中引物浓度必须适宜，引物浓度过 高会引起引物与模板之间的错配率增高，即非特高会引起引物与模板之间的错配率增高，即非特 异性产物增多，且可增加形成引物二聚体的机率异性产物增多，且可增加形成引物二聚体的机率 ；反之，则；反之，则PCRPCR扩增效率降低。但由于本实验所需扩增效率降低。但由于本实验所需 要确定的参数过多，所以先将这一参数