LOGO第三节 DNA多态性分型技术四川大学华西公共卫生学院 张薇薇Email: solozww163.com. Q Q: 363002530分型技术有那些?- 血清学分型 - 生物化学分型 - 噬菌体分型 . 传统的分型技术 分子生物学分型技术- PFGE - 限制性酶切图谱分析 - PCR技术 - 质粒图谱脉冲场凝胶电泳 pulsed-field gel electrophoresis PFGE原 理 琼脂糖凝胶依靠不同的分子筛效应对大小不同的DNA分子进 行分离。超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以 相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大 小无关，而主要决定于电场强度。但 PEGE 解决了这一问题原 理PFGE利用定时改变电场方向的交流电源，每次电流方向改变持续l s到5min左右，然后改变电流方向反复循环，故称为脉冲式交变电场。随着电场方向的交替变化，DNA分子呈“Z”形向前运动。每改变一次电场方向，大的伸展的DNA分子就必须重新定向，在新的方向上通过凝胶。重新定向所需的时间与DNA分子的长度成正比。B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图（1）细菌培养 （2）制备胶块 （3）菌体裂解 （4）胶块洗涤 （5）酶切 （6）电泳 （7）结果处理 PFGE图谱获得过程最大限度的 保证全基因 组的完整性脉冲式交变 电场 PFGE 优势重复性好,分辨力强, 被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准” PFGE 的局限性 无法分辨点突变、微小突变 内切酶选择很关键，否则无法找到图谱 费时，仪器要求高，技术要求高，成本较高PFGE的优势和局限性任何一种技术都不是完美的！还有没有其他技术作为补充？DNA多态性 ?分型技术?Yes!自然界的生物的个体差异我是独一 无二滴!DNA多态性在微生物中的实际意义？将导致不同的细菌亚型耐药菌株出现毒力变异株出现抗原漂移与抗原变异。在疾病预防控制中的应用 同源性追踪 细菌分型 传染控制DNA多态性分析常用的方法 限制性片段长度多态性分析技术 (RFLP) 扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP) 随机扩增多态性DNA分析技术 (RAPD) 细菌基因组重复序列PCR技术 (rep-PCR) 脉冲场凝胶电泳 (PFGE)。DNA多态性分析常用的方法 限制性片段长度多态性分析技术 (RFLP) 扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP) 随机扩增多态性DNA分析技术 (RAPD) 细菌基因组重复序列PCR技术 (rep-PCR) 脉冲场凝胶电泳 (PFGE)。 1974年首创，以DNA-DNA杂交为基础的 第一代遗传标记，是限制性内切酶、核酸电泳 、印迹技术、探针-杂交技术的综合应用一、限制性片段长度多态性分析Restriction fragment length polymorphism，RFLP 因此，RFLP即是基于限制性核酸内切酶酶切消 化核酸及标记的DNA探针能与任何序列相似的片 段杂交，通过片段长度变异性来检测生物体多态 性基 本 原 理每种生物基因型具有其独特的特征，及独特的 限制酶识别序列分布，其基因组DNA在限制性内 切酶作用下，产生相当多的大小不等片段，这些 片段经电泳以后几乎是连续排列的，如用放射性 同位素标记的DNA作探针，将与被标记的DNA相 关的片段检测出来，即可构建出多态性图谱。核酸分子杂交技术原理v 核酸经加热变性后，在低于变性温度 20 30时，反应系统中加入的核酸探针与待测核酸样品中具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构，通过检测标记信号即可检测特定的核苷酸片段。 RFLP操作流程图基本 方法 转移电泳槽聚合酶链反应-限制性片段长度多态 性分析技术 PCR-RFLP基本原理结合PCR技术与RFLP技术的优点，其基本原 理是对目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，不同基因序列，不 同限制性内切酶酶切扩增产物，在电泳后可产生不 同电泳图谱，通过对电泳图谱的分析，得出基因多 态性结果。*四川大学华西公卫 裴晓方 26Kary Mullis1993 年因此荣获诺贝尔化学奖 v聚合酶链反应是在体外酶促扩增特定DNA或 RNA片段的技术。 v由变性 、 退火 、 延伸三个基本步骤构成 PCR反应五要素的优化1、多聚核苷酸引物2、Taq DNA聚合酶3、dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）4、模板核酸5、缓冲液基 本 程 序 1. 提取DNA2. 设计特异引物进行目的基因PCR反应3. 将DNA扩增产物选用合适限制性内切酶酶切4. 将酶切出来的具各种长度的DNA片段在琼脂 糖凝胶上电泳分离5. 对显示出来的带谱进行分析。 RFLP与PCR-RFLP的应用1.结核分枝杆菌IS6110-RFLP分析2.厌氧菌16SrRNA基因PCR-RFLP分析 3.其他 我的肥胖课题PPAR-2及UCP2基因多态性与成都地区 单纯性肥胖相关性初探 PPAR-2 调节脂肪组织分化，脂质代谢方面发挥关键作用其基因突变发生于染色体3p25外显子2的第12位密码子CCA-GCA突变造成脯氨酸转变为丙氨酸，即PA多态性 UCP2 调节机体的基础代谢率(BMR)来控制体重其定位于人类11号染色体(11q13)外显子2 ，第55位密码子GCA-GTA突变造成丙氨酸转变缬氨酸，即AV多态性600bp 500bp400bp300bp 250bp200bp150bp 126bp100bp 98bpMaker 1 2 3 图9 UCP2 PCR产物经Bbv内切酶酶切后3.5%琼脂糖凝胶电泳结果 注：基因型为AA型:被酶解为98bp,1条带(第3泳道);基因型为AV型:被酶解为126bp、98bp，2条带(第1泳道)基因型为VV型:被酶解，仍为126bp l条带(第2泳道)A VV VAADNA多态性分析常用的方法 限制性片段长度多态性分析 (RFLP) 扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP) 随机扩增多态性DNA分析技术 (RAPD) 细菌基因组重复序列PCR技术 (rep-PCR) 脉冲场凝胶电泳 (PFGE)。二、扩增片段长度多态性分析技术Amplified fragment length polymorphism，AFLP 结合了限制性酶切消化的可靠性和严格的PCR 退火条件，有高度特异性，既克服了RFLP技术中 Southen杂交繁琐和耗时的缺点，又解决了RAPD等 技术中非特异PCR扩增引起的可信度问题。 AFLP技术的发明基 本 原 理AFLP指纹图谱是通过PCR技术扩增基因组DNA限制性酶切片段，然后在高分辨率聚丙烯酰胺凝胶或毛细管凝胶中电泳而获得。AFLP技术检测的是酶切位点单核苷酸改变或其临近的用于AFLP引物退火的核苷酸改变所致的序列多态性。补充原理图AFLP原理和操作流程图基因组DNA提取酶切与接头连接PCR扩增电泳分析基本程序例子：EWGLI制定的军团菌AFLP分型标准方法1. 细菌培养和模板制备 初次分离的军团菌单个菌株在BCYE-琼脂平板上二 次传代，3537培养23d，确定为纯培养。挑取次代 纯培养菌落用Nucleon BACC2配套DNA提取液，RNase A酶消化后提取基因组DNA。在260nm吸光度测定基因 组DNA浓度。 2. 限制性酶切与连接反应 限制性酶切与连接反应体系包括基因组DNA、接头 AFLP-LG1（5-CTCGTAGACTGCG TACATGCA-3 ）、接头AFLP-LG2（5-TGTACGCAGTCTAC-3） 、Pst酶、T4连接酶、1酶连接缓冲液，37反应3h 。与接头连接好的标记DNA片段用2.5mol/L醋酸胺、 纯乙醇沉淀。室温孵育5min后，4 12000g离心 10min，70%乙醇洗一次，沉淀物干燥后加入100l TE 缓冲液配成悬液，-20保存。3. PCR扩增 PCR扩增反应采用处理过的固化Taq酶珠， 反应体系包括模板DNA ，选择性引物（AFLP- Pst-G：5-GACTGCGTACATGCAGG-3）， dNTP，2.5mmol/L MgCl2。热循环参数为： 94 1min，60 1min，72 2.5min，循环33次。 4. 凝胶电泳 1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压3.45V/cm，电 泳4h。需在每一个样品电泳带旁加一个分子量 标记条带。每块胶的第一个样品孔加入来源于 EWGLI标准化分型的Dresden AFLP015型 AFLP产物（EUL No.137）。凝胶经EB染色 30min，紫外光下照相或数字记录。5. 数据分析 将未知型在EWGLI建立的军团菌AFLP 型数据库中分析，聚类分析以条带的选择为 基础，分群分析通过DICE系数和应用平均数 的非加权成组配对法（UDGMA）。条带位置 容许误差=2%，最优化位置=0.5%。可分析 300bp2500bp的DNA扩增片段。补充原理图AFLP原理和操作流程图影 响 因 素 1. 限制性内切酶（1）一般采用双酶切（2）由一个高频内切酶和一个低频内切酶组成（3）一般高（G+C）摩尔分数的基因组选择识别位 点富含（G+C）的内切酶组合；低（G+C）摩尔分 数的基因组选择识别位点富含AT的内切酶组合（4）酶切反应对模板质量要求很高（5）酶切时间1 3h（6）DNA含量一般0.5g左右，DNA含量不应太高 2. 接头接头是人工合成的一段短核苷酸双链，一 般长度是1117个核苷酸，由中心序列和限制酶 切特异序列两部分组成。注意接头5端为非磷酸 化，以防接头间的连接并保证其只能在3端与限 制性片段连接。 Apa(GGGCC/C)接头的结构5- TCGTAGACTGCGTACA GGCC- 3 3- CATCTGACGCATGT-5中心序列酶切位点补充原理图AFLP原理和操作流程图3. 引物设计引物由三部分组成：与接头序列匹配的中心序列，相 应的酶切位点和3端的选择性碱基。如Apa 引物：5-GACTGCGTACA GGCCC NNN-3中心序列 Apa切点 选择性碱基重要特征是所有引物5 端是G碱基, 可有效防止双 链的形成引物。设计主要在选择性碱基数目及组合上。选择性碱基 通常为13个，对基因组较复杂的生物体在两个引物 的3端至少有3个选择性核苷酸才能获得合适指纹图， 而细菌基因组小，一般1个选择性核苷酸即足够了。补充原理图AFLP原理和操作流程图GG4. 扩增条件 AFLP反应条件与常规PCR主要不同之处是采用温 度梯度PCR，即PCR始于高温复性（一般采用65， 比常规PCR退火温度高10左右）以期获得最佳选择 性，以后退火温度逐步降低（每循环降低0.7），一 直降到最适退火温度，然后在这个温度下完成其余 PCR循环。对于复杂基因，一般采用两步法扩增。应 用 1. 细菌分型 军团菌、大肠杆菌、根瘤土壤杆菌、 表皮葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、黄杆菌属 、气