分子标记在花生上的应用现状及前景作物遗传育种周金超导师：刘立峰Introduction花生(Arachis hypogaea)(2n=4x=40) 是世界范围内广泛栽培的油料与经济 作物,是20世纪全球最重要的四大油 料作物之一。花生种仁中脂肪和蛋白 质占80%以上,含有人类必需的8种氨 基酸以及脂肪酸亚油酸,另外含有铁 、钙、锌等矿质元素, 素有“长寿果 ”之美称。 Introduction我国在世界花生生产中占有极为重要的 地位, 1993年以来花生总产和消费量稳居 世界之首。基于花生在国民经济和人民生 活中所占的重要地位,其遗传研究一直受到 广泛重视。常规育种方法存在育种周期长 、对目标单株的选择效率低、成本高等难 以克服的缺点。利用分子标记，可以在DNA 分子水平上科学地选配育种亲本，利用与 重要目标性状连锁的分子标记则可以对杂 种后代进行科学的选择。Introduction花生在形态、生理、农艺性状等方面存在 着丰富的变异，而在DNA分子水平上揭示的 多态性较少。由于花生遗传背景的复杂性 ，DNA多态性的限制，这个极大的限制了分 子标记辅助选择在花生育种上的应用。目 前花生DNA分子标记研究明显落后于其他作 物。因此，筛选花生多态性标记是花生育 种的工作重点。分子标记的优点利用分子标记, 可以在 DNA 分子水平上 科学地选配育种亲本、利用与重要目标性状 连锁的分子标记则可以对杂种后代进行科学 的选择, 而且不受环境条件和作物生育期的 影响,鉴定结果稳定可靠,具有选择效率高、 准确性高、成本低等优点,可大大缩短育种时 间。花生育种中常用的分子标记种类1.基于Southern杂交的分子标记RFLP：restriction fragment length polymorphism小卫星DNA：minisatellite DNA2.以 PCR(聚合酶链式反应)为基础的分子标记RAPD：random amplified polymorphic DNASSR: simple sequence repeatSCAR： sequence characterized amplified regionsAFLP： amplified fragment length polymorphismSRAP： sequence related amplified polymorphism分子标记在花生中的应用1.遗传多样性的研究 2.抗性的研究 3.杂交后代的鉴定 4.构建花生遗传图谱 5.花生油酸/亚油酸比值( O/ L)的研究 6.构建花生指纹图谱 1.遗传多样性的研究姜慧芳等利用RAPD 技术对7个不同植物学 类型的花生种质资源进行了分析,在所用 的83个随机引物中,13个引物的扩增产物 显示出不同品种间的多态性,能显示花生 品种间DNA 多态性的引物占15.7%,这13个 引物共扩增出121条DNA带,其中具多态性 的片段26条,占21.48%。1.遗传多样性的研究 叶冰莹等用RAPD技术分析了12个花生品种 的遗传多样性,从80个随机引物中筛选出 20个进行扩增,共扩增出180条带,其中132 条具有多态性,占73.33%，平均每个引物 提供9个RAPD标记的信息量。 韩柱强等利用11对SSR引物对24个栽培花 生种(包括4大类型)进行PCR扩增分析,其 中4对检测到明显的多态性,共检测到33个 等位基因变异,每一个位点上检测到的变 异数为513个,平均8.25个,根据扩增结果 可以将24个品种中的21个相互区分。1.遗传多样性的研究 陈强等对32个来源于中国不同产地的花生品 种进行了AFLP指纹图谱及相似性聚类分析。 结果表明: 所有供试花生品种的遗传相似性 为 35%,在45%的相似性水平上分为3个群 表 明中国花生品种存在遗传多态性。 王传堂等研究了分属3个市场型的10个中国 花生栽培种的序列相关扩增多态性。根据 SRAP 指纹图谱进行聚类分析可将这10个 品种分为4类。2.抗性的研究雷永等成功地将AFLP标记E45/M53- 440转化为实验结果稳定、操作更简单 的SCAR标记AFs-412,标记与花生黄曲 霉侵染抗性间的遗传距离为6.5cM。利 用获得的SCAR标记对抗、感黄曲霉的 花生种质资源进行了分子鉴定, 结果 表明,标记与抗性鉴定结果具有较高的 一致性,证实了该标记应用于研究群体 之外的育种潜力。2.抗性研究 姜惠芳等以抗青枯病花生品种“9102”与 感病品种中花5号杂交,通过“单粒传”法 构建了青枯病抗性重组近交系群体 (RILs),含123个家系。用164对SSR引物鉴 定亲本DNA多态性及其最佳反应体系和反 应条件,获得能检测RILs群体多态性的引 物11对及其最佳反应体系和反应条件。用 能显示多态性的引物对RILs F6代群体进 行检测, 获得多态性标记10个。3.杂交后代的鉴定可以通过分子标记来判断外源基 因是否导入到杂交后代中去,仅凭观 察形态性状很难准确判断并且耗费时 间,而且容易受环境条件的影响。利 用分子标记技术就可以比较容易地克 服上述问题。4.构建花生的遗传图谱Halward 等利用二倍体野生种种间杂 A.stenospermaA.cardenasii后代群 体,构建出花生的RFLP图谱,该图谱覆 盖图距为1400cM,定位了117个RFLP标 记,分布在11个连锁群上,编码与脂肪 生物合成有关酶的基因的3个cDNA克隆 已被定位在图谱上。5.花生油酸/亚油酸比值( O/ L)的研究 花生油脂品质包括营养成分和耐贮藏 特性两个方面。花生品种的油酸/亚 油酸比值(简称O/L比值)是花生及其 制品耐贮藏性的重要指标,O/L比值越 高,花生及其制品耐贮藏性越好,货架 寿命越长。5.花生油酸/亚油酸比值( O/ L)的研究Lpez等从两个亲本T90和F435中,扩增出 一个3525bp大小的片段,通过高油酸和低 油酸序列比较, 发现几个单核苷酸的差异 (SNPs),两个变异和高油酸有关,一个是在 编码区后442bp处插入了一个核苷酸A转换 了氨基酸的可读框。另一个是在448bp处 一个核苷酸的变化,导致了一个氨基酸的 替换。5.花生油酸/亚油酸比值(O/L)的研究研究发现当第150位氨基酸为天冬氨酸 (D)时,酶活性较高(ahFAD2A),油酸含量 低;在ahFAD2B 中,150位为天冬酰胺 (N),或用点突变将ahFAD2A中的D变为N 时,酶活性降低,油酸含量增加。6.构建花生指纹图谱 陈强等对32个来源于中国不同产地 的花生品种进行了AFLP指纹图谱及相 似性聚类分析。结果表明: 所有供试 花生品种的遗传相似性为35%,在45% 的相似性水平上分为3个群,表明中国 花生品种存在遗传多态性。翁跃进等利用AFLP技术对从国际半干 旱所(ICRISAT)引进的9份花生抗旱品种 绘制指纹图谱, 通过引物 E-ACA 和与之 匹配的M-CAG和M-CAT, 在300 6000bp的范围内共获得1577条AFLP扩 增产物, 每个品种有主带和次带至少71 条之多, 其中10条为多态性的带纹。利用4 个标记的引物扩增带型构成19 个品种 的特异性指纹, 根据指纹图谱的差异使它们相 互区分。本实验室利用 20 对 SSR引物对75个河北省 不同植物类型花生地方品种遗传多样性进行 分析。共检测到65个等位基因，品种间不同 位点等位基因数目不等，范围为 26 个，平 均 3.25个，其中以 PM15、PM377 的等位变 异数最多，为 6个。通过计算20对引物在不 同品种间的多态信息指数和聚类分析将河北 省地方品种区分、归类。分子标记在花生育种上的贡献In order to develop a genetic linkage map for tetraploid cultivated groundnut, a total of 1,145 simple sequence repeat (SSR)markers were screened on two genotypes, TAG 24 and ICGV 86031 that are parents of a recombinant inbred line mapping population. MethodResult144 (12.6%) polymorphic markers were identified and these amplified a total of 150 loci. A total of 135 SSR loci could be mapped into 22 linkage groups (LGs).Material and methodThree recombinant inbred lines (RILs) populations were constructed from three crosses with one common female parental line Yueyou 13, a high yielding Spanish market type. The four parents were screened with 1044 primer pairs designed to amplify SSRs and 901 primer pairs produced clear PCR products. ResultThe composite linkage maps consist of 22 composite linkage groups (LG) with 175 SSR markers (including 47 SSRs on the published AA genome maps), representing the 20 chromosomes of A. hypogaea. The total composite map length is 885.4 cM, with an average marker density of 5.8 cM.Experiment PurposeThe objective of this study was to develop a comparative integrated map from two cultivated cultivated recombinant inbred line (RIL) mapping populations and to apply in mapping Tomato spotted wilt virus (TSWV) resistance trait in peanut.ResultA total of 4,576 simple sequence repeat (SSR) markers were used for screening polymorphisms.A total of 324 markers were anchored on this integrated map covering 1,352.1 cM with 21 linkage groups (LGs).分子标记的应用前景通过分子标记技术研究花生种质资源 的 DNA 分子多态性,从分子水平上揭示花生 种质资源的遗传变异,筛选出适合花生种质 资源指纹图谱鉴定的分子标记技术, 找出不 同花生种质资源间的分子标记,直接为花生 品种改良和种质资源的鉴定、保存提供可靠 的遗传标记和新技术新方法,为下一步研究 各种遗传标记的遗传连锁关系、分子标记辅 助育种、遗传图谱构建、数量基因座定位及 基因克隆打基础,对花生染色体组结构和功 能基因组研究等方面也有重要意义。谢 谢