双脱氧末端终止法测序的原理、过程和目标基因序列的分析教 师：程 琳2011 年 11 月分子生物学实验1实 验 目 的1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原理，掌握DNA测序的基本方法；2、学会序列查询、核酸及蛋白质的同源性搜索和比对。2DNA测序技术主要有两种方法，都是在20世 纪70年代中期发明的。 A. 双脱氧链终止法（the chain termination method），是通过合成与单链DNA互补的多核苷 酸链来读取待测DNA分子的顺序。 B. 化学降解法（chemical degradation method） ，是将双链DNA分子用化学试剂处理，产生切口，用同位素标记进行测序。一、DNA测序的方法31. Sanger双脱氧链终止法测序原理利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定 DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生 物学实验室的生物化学 家F. Sanger等人于1977年发明的。4基本原理： 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的 DNA分子； 利用DNA聚合酶不能够区 分dNTP和ddNTP的特性， 使ddNTP参入到寡核苷酸链 的3-末端。因为ddNTP 3不 是-OH，不能与下一个核苷 酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。562、具体操作：测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。7同理第二个反应产生的都是以C结尾 的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反 应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列 了.8假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或 ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终 止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产 生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是 ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以 继续延伸, 产生GATCCGAT. 将得到如下结果：1产生的都是以A结尾的片段: GA,GATCCGA。234产生的都是以C结尾的片段: GATC, GATCC产生的都是以G结尾的片段: G, GATCCG 产生的都是以T结尾的片段: GAT, GATCCGAT 9制得的四组混合 物全部平行地点加在 变性聚丙烯酸受凝胶 电泳板上进行电泳， 每组制品中的各个组 分将按其链长的不同 得到分离，从而制得 相应的放射性自显影 图谱。从所得图谱即 可直接读得DNA的碱 基序列。 即可得到测序结果：为GATCCGAT10制备单链模板 将单链模板与一小段引物退火 加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列3、技术路线 ：114、 高通量自动化测序 DNA 序列分析自动化包括两个方面的内容，一方面是指“分析反应”的自动化，另一方面是指“读片过程”的自动化。自动化的DNA 序列分析，也是根据Sanger 双脱氧链终止DNA测序法的基本原理发展起来的。12自动化测序原理自动化测序类似于PCR反应，但只用一条引物，反应混合物中 含有不同荧光标记的ddNTP与4 种dNTP。由于每种ddNTP带有 各自特定的荧光颜色,而简化为由 1个泳道同时判读4种碱基。产物条带经过检测仪时给出特定信号 ，由计算机判读并记录。 优点 ：可用双链DNA做模板；模板用量少，不必克隆；可实现 高通量自动化。13高速自动DNA测序仪的结构及工作原理由激光发射器产生的激光束，通过精密的光学系统 后被导向凝胶表面的检测区 。在此，激光束垂直射向凝 胶，同经过检测孔的DNA片段发生作用，并提供能量激 发荧光发色基团发射出具特 异性波长的荧光。这些荧光 通过聚焦镜集中后传给滤光 镜/棱镜组件，以便四种碱基产生的不同标记波长区别 开来。经成像透像最后由高 灵敏度的相机分段收集信号 ，传送给计算所分析处理。14荧光化合物标记链终止法以荧光颜色 为标记信号，每种 ddNTP各有1种代表颜色；整个反应在一 个试管中进行；当新 合成的终止单链通过 荧光监测仪时，可由 光信号读出末端核苷 酸并由电脑记录。1516Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力 ： 手工测序：最大约300 bp； 自动测序：最大约1200 bp。17二、序列比对分析1. 相似性与同源性 相似性(similarity)：是指一种很直接的数量关系，比如部分相同或 相似的百分比或其它一些合适的度量。比如说，A 序列和B序列的相似性是80，或者4/5。这是个量化的关系。当然可进行自身局部比较。18同源性(homology)：指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质序列具而共同祖先的结论，属于质的判断。 就是说A和B的关系上，只有是同源序列，或者 非同源序列两种关系。而说A和B的同源性为80都是不科学的。19序列的相似性和序列的同源性有一定的关系，一般来说序列间的相似性越高的话，它们是同源序列的可能性就更高，所以经常可以通过序列的相似 性来推测序列是否同源。正因为存在这样的关系，很多时候对序列的相似性和同源性就没有做很明显的区分，造成经常等 价混用两个名词。所以有出现A序列和B序列的同源 性为80一说。20序列相似性比较：就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就 是找出与此序列相似的已知序列是什么。完成 这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用 的程序包有BLAST、FASTA等；21序列同源性分析：是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比 较，以确定该序列与其它序列间的同源性大 小。这是理论分析方法中最关键的一步。完 成这一工作必须使用多序列比较算法。常用 的程序包有CLUSTAL等；222. Blast简介及应用（1）Blast简介BLAST 是由美国国立生物技术信息中心（NCBI）开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。BLAST是“局部相似性基本查询工具”（Basic Local Alignment Search Tool）的缩写。23Blast 是一个序列相似性搜索的程序包，其中包含了很多个独立的程序，这些程序是根据 查询的对象和数据库的不同来定义的。比如说 查询的序列为核酸，查询数据库亦为核酸序列 数据库，那么就应该选择blastn程序。下表列出了主要的blast程序：24主要的blast程序程序名查询序列数据库搜索方法Blastn核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列Blastp蛋白质蛋白质蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的 序列 Blastx核酸蛋白质核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白 质数据库中的序列逐一搜索。 Tblastn蛋白质核酸蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列6 框翻译后的蛋白质序列逐一比对。 TBlastx核酸核酸核酸序列6框翻译成蛋白质序列，再和核 酸数据库中的核酸序列6框翻译成的蛋白 质序列逐一进行比对。25（2） Blast资源1、NCBI主站点：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/（网络版）ftp:/ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ （单机版）2、其他站点：http:/life.zsu.edu.cn/blast/http:/nema.cap.ed.ac.uk/ncbi_blast.html http:/www.fruitfly.org/blast/（果蝇）26Blast结果会列出跟查询序列相似性比较高，符合限定要求的序列结果，根据这些结果可以获取以下一些信息：1.查询序列可能具有某种功能；2.查询序列可能是来源于某个物种；3.查询序列可能是某种功能基因的同源基因；这些信息都可以应用到后续分析中。 27（3）Blast应用登陆ncbi的 blast主页核酸序列蛋白序列翻译序列底下有其他一些针对特 殊数据库的和查看以往 的比对结果等28Blast任务提交表单11.序列信息部分填入查询（query）的序列序列范围 （默认全部）选择搜索数据库如果接受其他参数默认 设置，点击开始搜索29Blast任务提交表单2设置搜索的范围，entrez关键 词，或者选择特定物种2.设置各种参数部分一些过滤选项，包括简 单重复序列，人类基因 组中的重复序列E值上限窗口大小如果你对blast的命令行选项熟悉的话，可以在这里加入更多的参数30Blast任务提交表单33.设置结果输出显示格式选择需要显示的选项 以及显示的文件格式显示数目Alignment的 显示方式筛选结果E值范围其他一些显示格式参数 点击开始搜索 31提交任务返回查询号（requestid）可以修改显示结果格式修改完显示格式后 点击进入结果界面32结果页面1 图形示意结果33结果页面2目标序列描述部分带有genbank的链接，点击可以进 入相应的genbank序列匹配情况，分值，e值34结果页面3详细的比对上的序列的排列情况35（4）一个例子假设以下为一未知蛋白序列 query_seqMSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRP QGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQI GYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYG ANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGT TLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPA RMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTK KSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGD QDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGT WLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKD KKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMS GASADST QA我们通过blast搜索来获取一些这个序列的信息。36具体步骤：1.登陆blast主页http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/2.根据数据类型，选择合适的程序3.填写表单信息4.提交任务5.查看和分析结果371.登陆ncbi的blast主页2.选择程序，因为 查询序列是蛋白序 列可以选择blastp ，点击进入也可以选择tblastn作为演示， 我们这里选blastp383.填入序列（copypaste） Fasta格式，或者纯序列4.选择搜索区域，这里我们 要搜索整个序列，不填5.选择搜索数据库，这里我们选 nr(非冗余的蛋白序列库)。是否搜索保守区域数据库（cdd ），蛋白序列搜索才有。 我们选上396.限制条件，我们限 制在病毒里面找。7.其他选项保持默认 值打分矩阵408.输出格式选项保持 默认值9.点击开始搜索4110.查询序列的一些 相关信息在cdd库里面找到 两个保守区域， 点击可以进入42图形结果43匹配序列列表44具体匹配情况45思 考 题1. 序列的同源性和相似性有什么区别？2. 在网上查询一个序列信息的步骤有哪些？46