1韭菜总黄酮的提取及对羟自由基的清除作用研究作者：黄锁义 林丹英 尤婷婷【摘要 】 目的探讨韭菜总黄酮的提取、鉴别及对羟自由基的清除作用，以充分利用韭菜植物资源，避免资源的浪费。方法采用超声波乙醇浸提法从韭菜中提取黄酮类物质，对所提取的黄酮类物质进行验证，并用分光光度法测定含量，用韭菜总黄酮对羟自由基清除作用进行试验。结果测得样品中总黄酮的含量 C=0.195 0 mg/ml，回收率为 100%，其纯度和产率均较高。结论该方法采用全物理过程，无任何污染，是提取韭菜黄酮类物质的有效途径。韭菜总黄酮提取液对 Fenton 体系产生的OH 自由基有很好的清除作用。 【关键词】 超声波提取 韭菜 总黄酮 自由基 清除Abstract：ObjectiveTo study the extraction of total flavanone of Chinese chives and its effect on hydroxyl radical. MethodsThe flavonoids were extracted from Chinese chives with ultrasonic wave and ethanol extraction.Spectrophotometry was used to determine the flavanone of Chinese chives. The effect of extracts from 2Chinese chives on hydroxyl radicals was studied ResultsBy this method the content of the total flavanone of Chinese chives was C=0.1950 mg/ml and the rate of recovery was100%. Conclusion This text provides the extraction and purifying methods to get the outcome and the purity of the flavanone is high .This method is a purely physical process and has no pollution. It is an ideal way to extract the flavanone of Chinese chives. Total flavanone from Chinese chives have scavenging effects on hydroxyl radicals.Key words：Ultrasonic wave treatment； Chinese chive； Total flavanone； Hydroxyl radical； Scavenging韭菜 Chinese chives 又叫长生韭、扁菜等，自古以来就受到国人的喜爱。韭菜因营养丰富，又有温补肝肾、助阳固精作用，故在中国药典上有“起阳草”之称。韭菜作为药用，最早见于梁陶弘景 名医别录 ，谓其能“安五脏，除胃中热” 1 。 食疗本草说它能“利胸膈” 。 本草拾遗说它能“温中，下气，补虚，调和脏腑，令人能食，益阳，止泻白脓， 腹冷痛，并煮食之” 。明代李时珍在本草纲目中写道，韭菜“补肝及命门，治小便频数，遗尿”等2 。韭菜味甘、辛，性温；有补肾助阳，温中开胃，散淤血等功效；药理研究发现其具有调节血脂、预防和治疗心血管3疾病的作用，在肠内有消毒、灭菌的功能。临床上常用作治跌打损伤、噎膈、反胃、肠炎、吐血、鼻衄、 胸痛、阳痿、早泄、遗精、多尿、神经性皮炎等症。现代研究证明，韭菜含有挥发油硫化物、蛋白质、脂肪、糖类、胡萝卜素、维生素 B 和 C、纤维素、钙、磷、铁等1 。近年来，超声技术应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等研究已有报道3，4 ，表明其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。很多研究表明，利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响4 。但超声技术应用于提取韭菜中黄酮类物质的研究尚未见报道。为此，本文报道用超声波乙醇浸提法提取韭菜总黄酮、鉴别及提取物总黄酮对羟自由基的清除作用。1 仪器与试剂1.1 仪器 KQ5200DB 型数控超声波清洗器（超声工作频率40KHz、江苏省昆山市超声仪器有限公司） ；UV-755B 紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂） ；ZF-I 型三用紫外分析仪 (上海顾村光电仪器厂)；SHB-III 循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公4司） 。1.2 试剂 95%乙醇 AR；亚硝酸钠 AR；硝酸铝 AR；氢氧化钠 AR；三氯化铝 AR；盐酸 AR；氨水 AR；冰醋酸 AR；醋酸乙酯AR；乙酸镁 AR；甲醇 AR；镁粉 AR；正丁醇 AR；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所） ；双氧水 AR；硫酸亚铁 AR；水杨酸AR；新鲜韭菜采自广西百色市。2 方法与结果2.1 总黄酮成分提取取新鲜韭菜，烘干，粉碎。称取韭菜粉末 6 g，加 80 ml 95%乙醇，超声波提取 2.5 h，抽滤。滤渣再加80 ml 95 %乙醇，超声波提取 2.5 h，抽滤，合并两次滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩 25 ml 左右为止，放置 250 ml 容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，得样品液。2.2 测定方法依据以芦丁为对照品测定韭菜中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜 pH 值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。2.3 定量实验-总黄酮的含量测定52.3.1 波长的选择取样品液适量，在 0.30 ml 5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液在420 700 nm 波长范围测定络合物的吸光度，络合物于 510 nm波长处有最大吸收，故测定时选用此波长。2.3.2 标准曲线的绘制分别精密吸取芦丁对照液（0.13 mg/ml）0.00 ，0.05 ，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml 于10.00 ml 容量瓶中，分别加入 5%亚硝酸钠溶液 0.30 ml，摇匀，静置 6 min；再加 10%硝酸铝溶液 0.30 ml，摇匀，静置 6 min；再加 4%氢氧化钠溶液 4.00 ml，用 60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置 12 min，以试剂作空白，于 510 nm 处测吸光度。吸光度测定结果见表 1。表 1 紫外可见分光光度计测定吸光度结果（略）2.3.3 提取物含量的测定精密吸取样品液 0.50 ml，置 10 ml容量瓶，按标准曲线的制备方法测定吸光度 A=0.124，根据回归方程：A=3.61910-3+12.34C，计算样品中总黄酮的含量 C=0.195 0 mg/ml。2.3.4 回收率实验精密量取样品液 2.00 ml，加入标准芦丁对照品 2.00 ml（0.13 mg/ml） ，同前样品测定方法操作测定吸光度，求出回收率为 100% 。2.4 定性实验-总黄酮的鉴别62.4.1 颜色反应紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈灰褐色并有荧光斑点。浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏30 s，立即在紫外光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加 1%乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点。盐酸 -镁粉反应：取乙醇提取液 1 ml 于试管中加镁粉，再加入浓盐酸数滴（1 次加入） ，在泡沫处呈紫红色。2.4.2 纸层析取样品溶液 10 l 点在滤纸上。用正丁醇 :醋酸:水=4:1:5（体积比）为展开剂，上行展开 5h，取出晾干。喷 1%氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可见荧光斑点。72.5 总黄酮提取物对OH 的清除作用参照 Fenton 反应的方法建立反应体系模型5 ，利用 H2O2 与 Fe2+ 混合产生OH，但由于OH 具有很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸，就能有效地捕捉OH，并产生有色产物。反应式如下：H2O2+ Fe2+ Fe3+OH+OH-该产物在 510 nm 处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除OH 功能的被测物，便会与水杨酸竞争OH，从而使有色产物生成量减少，采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系(8.8 mmol/L H2O21 ml，9 mmol/L Fe2+l ml，9 mmol/L 1 ml 水杨酸-乙醇溶液)加入一系列不同浓度的韭菜总黄酮提取液，并以蒸馏水为参比，与试剂空白液比较，在 510 nm 处测量各浓度下的吸光度，便能测定被测物(总黄酮) 对OH 的清除作用，其清除率计算公式：清除率()=A0-AxA0100%以实验的提取液总黄酮作为样品，分别取不同体积的样品定容到10 m1 分别测其对OH 的清除作用。从图 1 中可看出，韭菜总黄酮提取液对由 Fenton 体系产生的OH 有一定的清除作用，随着韭菜总黄酮提取液浓度的增加，对OH 自由基的清除能力也增强，说明当黄酮类物质的浓度增加时，其清除率也增大。3 讨论8实验结果表明，本实验方法工艺简单，回收率为 100%。利用本实验所提供的超声波提取、纯化方法而得到的黄酮类物质其纯度较高。超声波可以强化乙醇浸提法，达到省时、高效、节能的目的，此方法采用全物理过程，无任何污染，是一条理想的提取黄酮类物质的途径，具有广阔的应用前景。黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分，具有很高的药用价值。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇） 、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等6 。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能。黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用7，8 。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目，韭菜分布广泛。本文实验结果表明，韭菜中含有较为丰富的黄酮，其提取物总黄酮对羟自由基具有很好的清除作9用。因此，韭菜具有广泛的开发和利用价值，值得综合利用，加强资源开发。【参考文献】1李振琼.药用蔬菜韭菜J. 家庭医药,2005,(5):54.2杨德俊. 四季佳蔬良药 J. 福建农业,2005,(5):38.3刘祥义. 超声波提取元宝枫叶总黄酮方法研究J. 云南化工，2003，30 （ 1）：27.4谢明杰，宋明，邹翠霞，等. 超声波提取大豆异黄酮J. 大豆科学,2004,23(1):75.5李贵荣，杨胜圆党参多糖的提取及其对活性氧自由基的清除作用J 化学世界，2001，42(8)：42l.6夏杏洲，张辉，魏传晚. 榕树叶中黄酮类化合物的提取条件研究J.食品研究与开发,2002,23(5):35.7黄锁义，黎海妮，余美料，等.益母草总黄酮的提取及鉴别J. 时珍国医国药,2005,16(5)：398.108黄锁义，覃成箭，姚小敏，等.洋葱总黄酮的提取及鉴别J. 时珍国医国药,2006,