11 12 2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1掌握目的基因获取的常见方法。(难点)2学会基因表达载体构建的方法和要求。(重点)3理解目的基因导入受体细胞的方法。(重点)4掌握目的基因检测与鉴定的具体操作。(重、难点)目 的 基 因 的 获 取1目的基因 (1)主要是指编码蛋白质的基因。(2)一些具有调控作用的因子。2获取方法(1)从基因文库中获取基因组文库：含有一种生物所有的基因。部分基因文库：含有一种生物的一部分基因，如 cDNA 文库。 (2)利用 PCR 技术扩增目的基因含义：是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。原理：DNA 双链复制。条件：引物、DNA 模板、Taq酶、四种脱氧核苷酸。过程。 a目的基因 DNA 受热变性后解链为单链(9095 )。b引物与单链相应互补序列结合(5560 )。c在 DNA 聚合酶作用下进行延伸(7075 )。d重复循环多次。 结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为 2n)。(3)人工合成法 条件：基因比较小，核苷酸序列已知。方法：通过 DNA 合成仪用化学方法直接人工合成。合作探讨探讨 ：基因组文库和部分基因文库有什么区别？12提示：基因组文库包含一种生物的全部基因，部分基因文库只包含一种生物的一部分基因。探讨 ：PCR 过程中需要解旋酶吗？所需要的 DNA 聚合酶应具有什么特点？2提示：PCR 过程中，DNA 双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于 PCR 过程温度较高，所以需要能耐高温的 DNA 聚合酶。探讨 ：什么样的基因适合用 DNA 合成仪直接人工合成？3提示：基因比较小，且核苷酸序列已知。思维升华1目的基因获取方法的选择(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中去获取目的基因。(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过 DNA 合成仪利用化学方法人工合成。(3)如果只知道扩增目的基因的两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可以通过PCR 技术扩增目的基因。2目的基因获取过程的比较(1)基因组文库：供体生物全部 DNADNA 片段受体菌群目的基因(2)cDNA 文库：供体生物mRNAcDNA受体菌群目的基因(3)PCR 技术：目的基因大量目的基因(4)人工合成：蛋白质的 氨基酸序列mRNA 核苷酸序列DNA 核苷酸序列目的 基因3PCR 技术与 DNA 复制的比较比较项目DNA 复制PCR 技术解旋方式解旋酶催化DNA 在高温下变性解旋场所细胞内(主要在细胞核内)细胞外(主要在 PCR 扩增仪中)酶解旋酶、DNA 聚合酶耐热的 DNA 聚合酶温度细胞内温和条件控制温度，需 55 95 高温区 别结果合成 DNA 分子合成 DNA 片段或基因联系(1)模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 (2)原料：均为四种脱氧核苷酸3(3)酶：均需 DNA 聚合酶 (4)引物：都需要引物，使 DNA 聚合酶从引物的 3端开始连接脱氧 核苷酸1下列获取目的基因的方法中需要模板的是( )从基因文库中获取目的基因 利用 PCR 技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA 合成仪利用化学方法人工合成 DNAA BCD【解析】 PCR 技术利用的是 DNA 双链复制原理，即将 DNA 双链之间的氢键打开，变成单链 DNA，作为聚合反应的模板。反转录法是以目的基因转录成的信使 RNA 为模板，在反转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链 DNA，再合成双链 DNA。则均不需要模板。【答案】 D2下列关于 cDNA 文库和基因组文库的说法中，不正确的是 ( )【导学号：72240004】AcDNA 文库中的 DNA 来源于 mRNA 的反转录过程B如果某种生物的 cDNA 文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同CcDNA 文库中的基因都没有启动子D一种生物的 cDNA 文库可以有许多个，但基因组文库只有一个【解析】 由于基因转录时只有编码区段才能转录，所以以 mRNA 反转录成的 DNA 就只有外显子区段，而缺少内含子和启动子等非编码区段，和原来的基因结构不相同。【答案】 B基 因 表 达 载 体 的 构 建 与 转 化(一)基因表达载体的构建核心 1基因表达载体的组成Error!2基因表达载体的功能(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。(2)使目的基因表达和发挥作用。(二)将目的基因导入受体细胞41转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2转化方法(1)导入植物细胞最常用方法农杆菌转化法：双子叶植物或裸子植物。其他方法a基因枪法：单子叶植物。b花粉管通道法。 (2)导入动物细胞常用方法：显微注射技术。常用受体细胞：受精卵。(3)导入微生物细胞方法a用 Ca2处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。b感受态细胞吸收重组表达载体 DNA 分子。受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。合作探讨探讨 ：用于构建基因表达载体的质粒为什么必须具有启动子和终止子？启动子和终止1子与起始密码和终止密码是一回事吗？提示：导入到受体细胞的目的基因的表达需要调控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有启动子，之后需有终止子。不是一回事，启动子和终止子都在 DNA 上，在遗传信息转录时起作用。启动子是启动转录的开始，终止子是 DNA 分子上决定转录停止的一段DNA 序列，其组成单位都是脱氧核苷酸。而起始密码子和终止密码子都是 mRNA 上三个相邻碱基。起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。探讨 ：农杆菌转化法利用了农杆菌的什么特性？2提示：农杆菌中的 Ti 质粒上的 TDNA(可转移的 DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体 DNA 上。探讨 ：植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用3受精卵？提示：植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞5一般只用受精卵。思维升华1基因表达载体的构建过程将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量 DNA 连接酶，形成一个重组DNA 分子(重组质粒)。构建过程如下图所示：2将目的基因导入受体细胞的方法比较生物类型植物动物微生物受体细胞体细胞受精卵原核细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射技术感受态细胞法转化过程以农杆菌转化法为例：将目的基因插入 Ti 质粒的TDNA 上转入农杆菌中导入植物细胞整合到受体细胞的 DNA 上提取含目的基因的表达载体显微注射受精卵发育具有新性状的个体Ca2处理细胞感受态细胞基因表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收 DNA 分子1下列关于基因表达载体构建的相关叙述，不正确的是( )A需要限制酶和 DNA 连接酶B必须在细胞内进行C抗生素抗性基因可作为标记基因D启动子位于目的基因的首端【解析】 基因表达载体的构建是指目的基因与载体结合，在此过程中需用同一种限6制酶切割目的基因与载体，用 DNA 连接酶将相同的末端连接起来；基因表达载体的构建是在细胞外进行的；基因表达载体包括启动子(位于基因首端使转录开始)、终止子、目的基因和标记基因(鉴别受体细胞中是否含有目的基因，如抗生素抗性基因)。【答案】 B2采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是 ( ) 【导学号：72240005】将毒素蛋白注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的 DNA 序列，注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的 DNA 序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养将编码毒素蛋白的 DNA 序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵A BCD【解析】 本题以抗虫棉培育为材料背景，主要考查基因操作中的第三步将目的基因导入受体细胞。导入目的基因必须选择恰当的载体，以保证导入目的基因不被受体细胞降解，并成功地实现复制、转录和翻译。【答案】 C目 的 基 因 的 检 测 与 鉴 定1分子水平检测(1)检测转基因生物 DNA 上是否插入了目的基因。方法：DNA 分子杂交技术。(2)检测目的基因是否转录出 mRNA。方法：分子杂交技术。(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质。方法：抗原抗体杂交技术。2个体水平鉴定包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。合作探讨探讨 ：目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键是什么？如何检测？1提示：目的基因是否插入受体细胞的染色体 DNA 上，这是其能否在真核生物中稳定遗7传的关键。检测方法是采用 DNA 分子杂交技术。探讨 ：什么是基因探针？如何检测目的基因是否开始发挥功能？2提示：基因探针是用放射性同位素标记的目的基因的单链 DNA 片段。从转基因生物中提取 mRNA，用标记的目的基因作探针，与 mRNA 杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了 mRNA，意味着目的基因开始发挥功能。探讨 ：检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？3提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。思维升华目的基因的检测与鉴定在不同方面的比较类型步骤检测内容方法结果显示导入检测目的基因是否导入受体细胞DNA 分子杂交技术(DNA 和 DNA 之间)是否成功显示出杂交带目的基因是否转录出 mRNA核酸分子杂交技术(DNA 和 mRNA 之间)是否成功显示出杂交带 分子检测表达检测目的基因是否翻译出蛋白质蛋白质分子杂交(抗原和抗体之间)是否成功显示出杂交带 个体生物学水平的鉴定 确定是否具有抗性及抗性程度基因工程产品与天然产品的活性是否相同抗虫或抗病的接种实验基因工程产品与天然产品活性的比较是否赋予了预期抗性或蛋白质活性1 DNA 探针是利用放射性同位素等标记的特定 DNA 片段。当 DNA 探针与待测的非标记单链 DNA(或 RNA)按碱基顺序互补结合时，形成标记 DNADNA(或标记 DNARNA)的双链杂交分子，可检测杂交反应结果。用某人的胰岛素基因制成 DNA 探针，能与之形成杂交分子的是( ) 【导学号：72240006】该人胰岛 A 细胞中的 DNA 该人胰岛 B 细胞中的 mRNA 该人胰岛 A 细胞中的mRNA 该人肝细胞中的 DNAA BCD【解析】 DNA 单链能与其互补链及其转录产生的 mRNA 分子互补配对而形成杂交分子；人体细胞中都有胰岛素基因，但此基因只有在胰岛 B 细胞中才能得到表达。【答案】 C82转基因抗虫棉培育过程中要对 Bt 基因导入受体细胞后是否可以稳定维持和表达进行检测与鉴定，其中利用到碱基互补配对原则的有( )检测棉花的 DNA 上是否插入了 Bt 基因 检测 Bt 基因是否在棉花细胞转录出 mRNA 检测 Bt 基因是否在棉花细胞翻译成蛋白质 检测 Bt 基因是否赋予了棉花抗虫特性ABCD【解析】 检测棉花的 DNA 上是否插入了 Bt 基因和检测 Bt 基因是否在棉花细胞转录出 mRNA 都是用标记的目的基因作探针进行分子杂交，因此都要进行碱基互补配对；检测Bt 基因是否在棉花细胞中翻译成蛋白质需进行抗原抗体杂交，检测 Bt 基因是否赋予了棉花抗虫特性需要做抗虫接种实