1香菇 C91-3 cDNA 文库的构建及鉴定作者：王晓丽，钟民涛，李星云，曹婧，宁安红，黄敏【摘要 】 目的构建香菇 C91-3 cDNA 文库。方法低速离心法收集香菇 C91-3 菌丝体发酵液中的菌丝，提取总 RNA，巢式 PCR 扩增 5SrRNA 非转录间隔区 2 片段并测序鉴定。纯化 mRNA，以mRNA 为模板进行反转录反应；产物与 pBlueScript II SK（+）载体连接，并转化 E.coil DH10B，检测库容及插入片段。结果香菇C91-3cDNA 文库初始库容为 7.2106cfu，插入片段长度0.43.4kb，平均 1.5kb。结论成功构建香菇 C91-3 cDNA 文库，适合用于研究香菇蛋白的编码基因。 【关键词】 香菇； cDNA 文库； 5SrRNA 非转录间隔区 2； 距离树； 库容香菇作为一种常用的药用真菌在预防、治疗恶性肿瘤方面都具有重要价值，其多糖提取物主要为 -1,3 键连接主链和 -1,6 键连接支链的葡聚糖，能够提高机体免疫功能，间接抑制肿瘤的生长1，2 ，具有突出防癌抗癌、提高免疫力及缓解化疗反应等作用3，4 ，现已正式被作为辅助化疗药物应用于临床，香菇也被我国列为抗癌资源植物5 。2香菇的生长周期为 23 个月，而生物发酵法培养 710 d即可收获，大大缩到了试验周期，并且发酵液中的多糖及氨基酸成分与报道中香菇子实体的分析结果一致。因此，多年来本课题组一直以香菇发酵液蛋白为研究对象。前期研究证实，香菇 C91-3 菌株发酵液具有直接抗肿瘤作用610 。香菇 C91-3 发酵液蛋白提取物能够抑制多种肿瘤细胞生长，大大延长荷瘤动物的生存期并且显著改善其生存状态。目前关于香菇 C91-3 发酵液中抗肿瘤效应蛋白的研究已经取得阶段性成果，本研究以香菇 C91-3 发酵液为 RNA来源构建 cDNA 文库，以便进行分子生物学水平的后续研究。1 材料与方法1.1 材料香菇 C91-3 菌种由大连医科大学微生物实验室保存。Chroma Spin+TE-1000 购自 CLONTECH 公司。克隆载体pBlueScript II SK（+） ，pMD19-T ；宿主细菌 E.coil DH10B，E.coil DH5；RNAiso plus，Oligotex-dT30 mRNA Purification Kit ，cDNA Library Construction Kit， Ex Taq Hot Start Version，修饰酶，DNA marker 等试剂以及 PCR 引物均来自 TaKaRa 大连公司。氨苄青霉素，X-Gal，IPTG，琼脂糖，胰化蛋白胨，酵母提取物购自大连晨钰生物试剂公司。其它试剂由大连医科大学提供。31.2 RNA 提取及来源检验香菇 C91-3 发酵液 100ml 无菌纱布过滤除渣后，低速离心集菌。沉淀研磨后加入 TaKaRa RNAiso plus 10ml，继续研磨至溶液透明，加入 2ml 氯仿抽提。加入预冷的无水乙醇，高速离心后 DEPC 处理水溶解沉淀。根据香菇5SrRNA 基因间非转录间隔区 2（IGR2）序列（GI：5688862） ，设计巢式 PCR 引物。1-上游引物：5-ACA TGA CCA AAC AAA CCC CT-3，1-下游引物 5-CTA AGC CCA AGC AAC CAC TG-3；2- 上游引物： 5-ATC TAG CTC GTT GAA GGG GA-3，2-下游引物 5-CTT GAC AAT GCG TTC TAC CG-3；使用 Ex Taq HS 酶扩增（ 94 30 s，55 30 s，72 1 min） 。PCR 产物与pMD19-T 载体连接后测序。总 RNA 溶液中加入等体积的Oligotex-dT30 mRNA Purification Binding Buffer（2） ，按TaKaRa 操作手册纯化 mRNA。1.3 cDNA 合成 5 g mRNA 为模板，按照 TaKaRa cDNA Library Construction Kit 操作手册进行反转录反应，合成的双链cDNA 的 3端含有 XhoI 酶切位点。双链 cDNA 两端连接 EcoRI Adaptor 后，XhoI 酶切。反应体系移入 Chroma Spin+TE-1000 Column 中，700 g 离心 5 min，收集管中即为大于 400bp 的双链cDNA。41.4 连接质粒载体质粒 pBlueScriptII SK（+）进行EcoRI/XhoI 双酶切。60 l 纯化的 cDNA 中加入 200 ng 开链pBlueScriptII SK（+） ，2 800 U T4 DNA Ligase，12过夜连接。连接产物回收，溶于 20 l TE。1.5 cDNA 文库鉴定取 0.5 l 重组质粒 110 稀释，预冷的0.1 cm 冲击槽加入 1 l 稀释液及 100 l E.coil DH10B 进行电转化，冲击条件 1.5 kV，200 ，25 F；冰上加入预冷的 SOC 培养基 1 ml，全量回收后 37振荡培养 1 h。分别取 1 l 培养液1100，1200，1500 稀释，10 l 稀释液涂布于 LB 琼脂糖筛选平板（含 X-Gal 20 g/ml，IPTG 24 mg/ml，Amp 100 g/ml） ，37过夜培养。计算初始文库库容。取 5 l 未稀释的培养物涂布于 LB/Amp 平板，37 过夜培养后，加入 LB/Amp 液体培养基 2 ml 洗脱菌落并回收，计算初级文库滴度。1.6 PCR 检测插入片段随机挑取 15 个白色菌落，SOC/Amp培养基 37过夜培养后，碱裂解法提取质粒，使用 T7、T3 引物进行 PCR 扩增。T7 引物： 5- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3；T3 引物：5- ATTAACCCTCACTAAAGGGAA -3；PCR 条件：94 30s，50 30s，72 1min。2 结果52.1 总 RNA 提取 2 l 总 RNA 溶液琼脂糖凝胶电泳，EB 染色后，紫外光下可见清晰 5SrRNA，18SrRNA 及 28SrRNA 条带（图 1-1） ， 28SrRNA 亮度约为 18SrRNA 的 2 倍，RNA 完整。A260/A280=1.92，RNA 纯度较高，符合建库要求。2.2 RNA 来源检验 2 l 巢式 PCR 产物 3%琼脂糖凝胶电泳，出现清晰的单一条带，长度约 400 bp（见图 2） 。测序结果：5-ATC TAG CTC GTT GAA GGG GAC CGG TGT ATT CTG GAC TGA GTT ATT GAT ATA TCT GTC TAA CAG AGC GTA CTA ACT TGG GAT GAA TAG TAT CAA GCT GTT AAC AAA GTG TTT TGC TTT GTG GCT TAC TTT GAG TCA AGC TCA TCT ACG AGT CTT GCA ATG TTG AAT GAA GTG GAT TAC TTG CTG ATA GCT AAA CCT GTT GCA TTT AAT CAT TTG AAA ATC CGC CGC GAC TGT GCG CGG TCC TTT GTC GAC TGT GCC GGT TGT TGG TAG TTT TCT TCG AAG ATT TTG ATA TTT GTT GCT GCA GAG CAA CAA GTA GAA AGA ATC TAG AAT TGT GAG AAC GGG GAA CAA GGT GGG TTG ATT GTG ACT TGA CAT TTG CTT GTA TAT TTC GGT AGA ACG CAT TGT CAA G-3，长度 404 bp。与 NCBI数据库中香菇 5SrRNA IGR2 序列吻合，二者一致性达98%（398/405） ，Gaps =0（2/405 ） ，图 3 为 NCBI 以 Fast Minimum Evolution 法生成的距离树。62.3 mRNA 纯化经 Oligotex-dT30 mRNA Purification Kit 处理后，取 5 l 溶液电泳，如图 12 所示，rRNA 亮带基本消失。2.4 cDNA 合成及短片段去除反转录得到的 cDNA 经 1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示 cDNA 长度为 0.53.4kb，呈 smear 分布，无特异性条带（图 4） 。2.5 文库鉴定质粒 pBlueScriptII SK（+）连接产物即为香菇C91-3 初始 cDNA 文库，库容为 7.2106 cfu，重组率为 97%。回收的洗脱菌液构成初级文库，初级文库滴度为 3.5105 cfu/ml。2.6 插入片段鉴定图 5 为 15 个随机菌落 PCR 扩增产物的 1%琼脂糖凝胶电泳结果，cDNA 插入片段的长度为 0.43.4 kb，平均1.5 kb。3 结论本实验的 RNA 来源为香菇 C91-3 发酵液，为排除杂菌污染，作5SrRNA 保守区段的 PCR 鉴定，扩增得到的 5SrRNA IGR2 片段与NCBI 数据库中记录的香菇 L54 菌株吻合。距离树分析显示已知的担子菌类真菌 5SrRNA IGR2 变异较大，毒伞蕈与扩增片段的一致性为 79%，松口蘑为 78%，双色蜡蘑为 77%。可见，香菇与这 3种担子菌在进化上有一定差异。7另外，在模板及插入片段的制备过程中，经过多次纯化，大大降低了基因组 DNA 及 cDNA 短片段的影响，因此，本文库质量较高，初始库容达到 7.2106 cfu 以上，即使是单拷贝基因也可以在本文库中找到，完全符合筛选文库要求。【参考文献】1高小荣，刘培勋.多糖构效关系研究进展J.中草药，2004，35 （ 2）：229.2李师鹏，安利国. 真菌多糖免疫活性的研究进展J.菌物系统，2001，20 （ 4）：581.3韩玲. 香菇多糖的临床应用进展J.中国新药杂志，2001，10 （ 2）：88.4Borchers AT，Stern JS，Hackman RM，et al.Minireview: Mushrooms，tumors， and immunityJ.Proc Soc Exp Biol Med，1999，221：281.5姚航海. 中国境内抗癌资源植物及其开发研究J.生物学教学，2005，30 （ 5）：7.86黄敏，宁安红，张卓然. 香菇 C91-3 菌发酵液小鼠体内外抗肿瘤作用的研究J.中国微生态学杂志，1996，8（3 ）：38.7黄敏，宁安红，张卓然.C91-3 菌发酵液治疗小鼠 H22腹水瘤对免疫变化的观察J.中华医学理论与实践，1998：6.8戴兵，黄敏. 香菇 C91-3 菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株 U14 生长及诱导凋亡的实验研究J . 浙江医学，2004，26 （ 9）：656.9张健，黄敏，宁安红，等.LFP91-3 对小鼠腹水瘤细胞端粒酶及腹水碱性磷酸酶、胆碱酯酶活性影响的研究J.中华实用医药杂志，2004，4 （19）：1729.10董晓宇，刘庆平，曹婧，等.香菇 C91-3 菌丝发酵液蛋白抗肿瘤免疫机制J.肿瘤学杂志,2006，1 （12 ）：64.