1第第 3535 讲讲 基因工程及其安全性基因工程及其安全性1基因工程的诞生() 2.基因工程的原理及技术(含 PCR 技术)() 3.基因工程的应用()4蛋白质工程() 5.实验：DNA 的粗提取与鉴定基因工程的操作工具1基因工程的概念理解(1)供体：提供目的基因。(2)操作环境：无菌。(3)操作水平：DNA 分子水平。(4)原理：基因重组。(5)受体：表达目的基因。(6)本质：性状在受体生物体内表达。(7)优点：克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物的遗传性状。2限制性核酸内切酶(简称：限制酶)(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)作用：识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(3)结果：产生黏性末端或平末端。3DNA 连接酶(1)功能：缝合被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)不同 DNA 连接酶的比较连一连2(选修 3 P6“寻根问底”改编)DNA 连接酶和 DNA 聚合酶的作用相同吗？试简要说明。答案：不相同。DNA 连接酶连接的是两个 DNA 片段，而 DNA 聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。 4载体(1)常用载体：质粒，其化学本质是独立于拟核之外的双链环状 DNA 分子。(2)其他载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒等。(3)特点及意义特点意义稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组 DNA 的鉴定和选择限制性核酸内切酶Mun和限制性核酸内切酶EcoR的识别序列及切割位点分别是和。如图表示四种质粒和目的基 因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是哪一种？并指明理由。答案：适合的质粒是。由图可知，质粒上无标记基因，不适合作为载体；质粒和的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点，使用该酶后将会导致标记基因遭破坏，故均不宜选作载体。 考向 1 限制性核酸内切酶、DNA 连接酶等酶的作用31(2016高考全国卷)图(a)中的三个 DNA 片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。(3)DNA 连接酶是将两个 DNA 片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。解析：(1)由图(a)可知，尽管BamH和Sau3A两种限制酶的识别位点不相同，但两种酶切割后产生的 DNA 片段具有相同的黏性末端，故被BamH酶切后得到的目的基因可以与图(b)中表达载体被Sau3A酶切后的产物连接。(2)运载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用，由于甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游，故这两个运载体上的目的基因都不能被转录和翻译。(3)常见的 DNA 连接酶是Ecoli DNA 连接酶和T4DNA 连接酶，但作用有所差别，T4DNA 连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，而Ecoli DNA 连接酶只能连接黏性末端。答案：(1)Sau3A 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(3)Ecoli DNA 连接酶 T4DNA 连接酶 T4DNA 连接酶4考向 2 载体的作用和特点分析2(2016高考全国卷)某一质粒载体如图所示，外源 DNA 插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后，与用BamH酶切获得的目的基因混合，加入 DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA 复制所需的原料来自_。解析：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：具有一个或多个限制酶酶切位点、具有标记基因、能够在宿主细胞中复制表达等。(2)由于未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞，均不含氨苄青霉素抗性基因，因而在含有氨苄青霉素的培养基上都不能生长，所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因(Tetr)失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。(3)噬菌体侵染细菌时，其进入细菌的 DNA，利用细菌细胞中的物质合成子代噬菌体的 DNA5和蛋白质外壳。据此推知：基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA 复制所需的原料来自于受体细胞。答案：(1)能自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点(答出两点即可)(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素(3)受体细胞载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：基因工程的基本操作1目的基因的获取(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。(2)方法从基因文库中获取 人工 合成利用mRNA反转录合成 通过DNA合成仪用化学方法人工合成) 利用PCR技术扩增)2基因表达载体的构建基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成(3)构建过程63将目的基因导入受体细胞项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射法转化法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞过程将目的基因插入到Ti 质粒的 TDNA 上导入农杆菌侵染植物细胞整合到受体细胞的染色体 DNA上表达Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA 分子4.目的基因的检测与鉴定如图为抗虫棉的培育过程，请据图回答下列问题：(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？7(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的 DNA 上？ (3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？答案：(1)目的基因是 Bt 毒蛋白基因，载体是 Ti 质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。(2)采用的方法是农杆菌转化法。由于 Ti 质粒上的 TDNA 可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体 DNA 上，而目的基因又插入到了 TDNA 上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体 DNA 上。(3)抗原抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。 1(2017高考全国卷)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的 RNA 序列的机制。已知在人体中基因 A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白 A)。回答下列问题：(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因 A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白 A，其原因是_。(2)若用家蚕作为表达基因 A 的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_作为载体，其原因是_。(3)若要高效地获得蛋白 A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因 A 是否翻译出蛋白 A，可用的检测物质是_(填“蛋白 A 的基因”或“蛋白 A 的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明 DNA 是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_。解析：(1)人