第四章 茎尖分生组织培养及脱毒苗生产一、概念和意义 1.概念 茎尖分生组织培养：指对不超过0.1mm的茎尖 或几十微米的茎尖进行的培养。 特点：可获无病毒苗，操作困难，成苗时间长 。普通茎尖培养：对几毫米至几十毫米长的茎 尖、芽尖及侧芽的培养。操作技术简单、易 成活、成苗时间短、繁殖速度快。 第一节 茎尖分生组织培养茎尖分生组织培养除可以生产脱毒苗外，还具有 方法简便，繁殖迅速，遗传性比较稳定，易保持植株 的优良性状的优点，在基础理论研究和实际应用中具 有重要价值。2.意义：1.形态建成研究 茎尖分生组织（茎尖分生组织（不带叶原基，不带叶原基，1mm1mm）4.育种中的应用 与辐射育种结合与辐射育种结合 l二、茎尖分生组织培养一般方法1.材料的制备健壮枝梢 去除叶片 分成1-2cm 自来水 冲洗 消毒 75%的酒精30秒 0.1%升汞或 20倍次氯酸钠消毒8-10min 无菌水 修剪 剥离茎尖，通常切割下顶端0.20.5 mm 叶原基的茎尖（无菌水） 接种。2.培养基 多为MS培养基及其改良配方，还有White 、B5等。 3.培养条件 （1）温度：2628（2）光照：光培养的效果通常比暗培养好 。 （3）湿度：与其他器官培养相似。一、病毒的危害多数栽培植物，尤其无性繁殖植物，都易受 到一种或几种，甚至几十种病毒的侵染。例如，草 莓感染60多种病毒。并且随着栽培时间的推移，侵 染病毒的种类越来越多。受病毒侵染的植物生长缓慢、畸形、产量大幅 度下降，品质变劣，甚至完全丧失商品价值。因此 说，病毒带来极大的危害。第二节 脱毒苗的培育和病毒检测l目前，对细菌和真菌侵染的病害，可以通过药物处理达到治愈的目的，如多菌灵等。但目前，还没有药物能治病毒病。l种子一般不带病毒，种子繁殖植物可以得到无菌植株。但对于无性繁殖植物，必须采用一种有效的方法，脱去病毒，才能达到提高产量和质量的目的。l二、病毒侵染的特点l早在40年代，就有科学家(White等)发现病毒在根上和茎上的分布是不均匀的，离根尖和茎尖越近，病毒的密度越低。反之，越高。即病毒在植物体内的分布是不均匀的，分生组织一般无病毒侵染。l分生组织之所以能避开病毒侵染，可能有4方面 原因：l1、在植物体中，病毒的移动主要靠两条途径， 一是通过维管系统，而分生组织中尚未形成维 管系统；二是通过胞间连丝，但这条途径病毒 移动速度非常缓慢，难以追赶上活跃生长的茎 尖和根尖。l2、在旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，使病毒无法进行复制。 l3、在茎尖中存在高水平内源激素，可以抑制病毒的增殖。l4、在植物体内存在有一种“病毒钝化系统”，它在分生组织中的活性应最高，因而使分生组织不受侵染。l 以上是四种可能原因，无论哪种说法正确，事实是分生组织一般不带病毒。因此，利用这一原理，进行茎尖培养，培育无病毒苗。植物脱病毒方法物理方法化学方法生物方法高温处理茎尖培养微体嫁接珠心培养愈伤脱毒热处理脱毒三、脱毒的方法l（一）热处理脱毒法l热处理脱毒原理l 病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞DNA一 起复制。l 热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒活性 ，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，失去 传染能力。l 作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂 ，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。热处理法有：温汤处理（热水浸泡）和热风 处理两种。l具体方法：l第一，热水浸泡处理，适用于切下的材料，在50度 左右的温水中浸渍数分钟至数小时，方法简便易行 但材料易受伤。l第二，热风处理，将生长的盆栽植物移入室内或生 长箱内，处理温度因植物种类、生理状况而异。一 般为3540度，短则几十分钟，长达数月。 l热处理的优缺点l优点: 方法简单，效果明显。l缺点: l1)具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形 病毒（苹果花叶病毒），或对线状病毒（马铃 薯卷叶病毒）有效；而对杆状病毒（千日红病 毒）无效。l2)热处理后只有小部分植株能够存活。极易使 植物材料受热枯死，造成损失l3）延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时 也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处 理效果。其它效果 香石竹（康乃馨）在3840下经两个 月处理可除去全部病毒。马铃薯在37下处理1020天能除去卷 叶病毒。l（二）茎尖培养脱毒 l1.茎尖培养脱毒的原理 l（1）病毒在植物体内的分布 l病毒浓度不同，离尖端越远病毒浓度越高。茎尖 或根尖离体培养便可获得无病毒再生植株。l必须指出的是，所谓无病毒，只是相对的，不是 绝对的。l（2）茎尖大小与脱毒 l茎尖外植体的大小与脱毒效果成反比。茎尖分生 组织不能合成自身需要，生长素，细胞分裂素， 因而带叶原基的茎尖生长快，成苗率高。因此茎 尖越大培养成活率越高。因此对不同植物脱毒适 宜的茎尖大小不同。2.茎尖培养脱毒的方法 （1）取样与消毒 可直接选定的植株上取顶芽进行消毒接种。 采顶芽与侧芽消毒接种。 消毒方法是：剪取顶芽梢段3、5厘米，剥去 大叶片，用自来水冲洗干净，在75%酒精中 浸泡30秒左右，用1%-3次氯酸钠或5%-7% 的漂白粉溶液消毒10-20分，最后用无菌水 冲洗材料4-5次。（2）接种 材料置1040倍的双筒解剖镜下，解 剖刀切取0.10.3mm带有12个叶 原基的茎尖，接种到培养基上。 （3）培养 接种后材料置25+2 ，光照度1500-5000LX，每日 光照10-16h条件下培养。但一般光照培养比暗培 养效果好。其间应更换新鲜培养基。提高培养基 中BA的浓度可形成大量从生芽。 3.培养基与培养方式 ： （1）培养基：常用MS， White等培养基。 （2）培养方式：茎尖培养一般采用半固体培 养基 l（三）、热处理与茎尖培养结合脱毒l果树等木本植物，热处理后新芽顶端嫁接成活率较 低。l茎尖培养时，茎尖过小成活率太低，而茎尖太大又 脱除不掉病毒l将热处理后的较大茎尖进行培养获得无病毒植株， 可以克服这些缺点。（四）微体嫁接离体培养脱毒法 应用微体嫁接的原因： 木本植物茎尖培养难以生根形成植株。 具体做法：将极小的茎尖（0.1mm0.2mm）作为接穗嫁接到不 带病毒的种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一起 在培养基上培养。 优点：接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖来培 养，去除病毒几率大，获得无病毒苗的可能性大。微嫁接要求的剥离技术高，嫁接成活率与接穗大小 呈正相关，而脱毒率与接穗大小呈负相关微体嫁接法脱除病毒的关键：要求剥离技术很高需要考虑砧木和接 穗对营养组成的不 同要求；与接穗的取材季节 有密切关系（苹果 46月取材嫁接成活 率较高。）（五）无病毒种苗的保存、应用及繁殖（1）无病毒原种的保存获得无毒原种不易，若保存不好会很快重 新感染病毒。为防止再度感染，应在隔离条件 下保存。若原种保存得好，无毒原种可以利用5-10年 ，在生产上可以创造更多的经济效益。1、隔离种植保存通过无毒原种要在隔离区或隔虫网室内种植保 存。植物病毒的传播媒介主要是昆虫如蚜虫、叶蝉 2、离体保存脱毒苗经鉴定后，选择无病原种株系，回接于 试管内，可长期保存，是最理想的保存方法。（2）无毒原种的应用获得无毒原种后，一方面要积极进行无毒苗 的推广，另一方面还要做好无病毒种的繁育。无毒苗的推广应在发展良种的新区使用才能 取得良好的效果；在老病区使用时应实行统一的 防治措施，一次性全区换种，才能取得应有的效 果。（3）无病毒原种的繁殖可在无毒源和其他病虫害的大田中进 行，场地土壤要进行消毒，防治蚜虫、线 虫和其他传毒媒介，并建立一套严格的原 种繁育制度和栽培管理制度，防止病毒的 再次感染。四、植物脱毒苗的鉴定 1、视觉观察法 (直接检测法) 看植株的茎叶是否有该病毒所有可见症状。番茄无菌小苗厚叶莲花掌植物病毒的症状植物病毒引起植株的症状是各异的，在观赏植物上 由病毒引起外部症状主要有以下几种：l（1）变色：褪绿、黄化、花叶、斑驳、红叶等，常见病 毒有；香石竹斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、芋花叶病毒等。l（2）坏死：常见的坏死是病斑或斑点。有轮斑、环斑、 条斑条纹等。如香石竹坏死斑点病毒、，凤仙花坏死斑 点病毒草等。l（3）畸形：植株可出现矮缩、矮化或叶片皱缩、卷叶、 蕨叶等病状。l（4）萎蔫 ：主要是指植物根或茎的维管束组织受到破坏 而发生供水不足所出现的凋萎现象。2、生物鉴定法 (指示植物indicating Plant法) 由于采用汁液接种法比较困难，所以通常采用 嫁接接种的方法, 利用嫁接法接种，把待测的植物接 种在敏感植物上，然后视其有无病斑，来判断是否脱 除了病毒。指示植物接穗嫁接后 的植物指示植物法l定义:将一些对病毒敏感、症状特征显著 的植物作为指示植物(又叫鉴别寄主),利 用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴 别病毒种类的方法.优点:方法简单灵敏准确擦方便,仍为一种经济有 效的方法 缺点:枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度,而只能 测出相对的感染力3、电子显微镜鉴定法 小于0.1mm的病 毒颗粒用电子显微镜直接 观察经脱毒培养的叶 片，检查是否有的病 毒粒子存在，还可测 量病毒颗粒的大小、 形状和结构。 较为先进的方法，但 需一定的设备和技术4、酶联免疫法在血清法的基础上，结合酶反应发展起来。在抗体上带上某种酶，抗原和抗体结合成的免疫复合物就有了酶活性，在反应体系中加入酶底物，底物在酶的催化下，形成有色反应物。从而使检测的灵敏度大大提高。l甘属育苗 取茎顶5cm，去掉老片 表面杀菌 剥取茎尖 培养，MS + 0.2mg/L NAA + 2 mg/L 6-BA 一个月后长出不定芽，高于5cm时从基部切下，MS基本培养基上 长大后，1-2个节间一段，新的MS基本培养基上继代培养，进行扩繁 炼苗4天左右，移栽沙子中 成活后，移栽塑料棚，再扩繁 田间栽培第三节 以甘薯为例介绍脱毒过程