高效毛细管电泳分析高效毛细管电泳分析High PerformanceHigh Performance Capillary ElectrophoresisCapillary Electrophoresis （HPCEHPCE）HPCE概念HPCE是经典电泳技术与现代微柱分离相 结合的一种快速、高效的液相分离技术。以高电场为驱动力在细内径毛细管内荷电粒子按其淌度或分配系数的不同分离特点：1. 高效：分离效能高2. 高速：分析速度快3. 微量：样品用量少4. 低消耗5. 应用范围广历史沿革（1）1937年Tiselius首次创造了电泳仪1948年成功从人血清中分离白蛋白和蛋 白,获诺贝尔化学奖但分离效率受热扩散和对流的影响1967年Hjerten最先提出高电场强度、直 径3mm的毛细管中作自由溶液区带电泳历史沿革（2）1981年Jceorgenson和Lukas提出用200um细 毛细管 1984年Terabe等将离子型表面活性剂胶束引 入毛细管电泳缓冲液体系中，胶束电动毛细管 色谱 1985年Hjerten提出毛细管等电聚焦1987年Cohen和Karger提出毛细管凝胶电泳， 实现了蛋白质碎片的分离 1988年后，高效毛细管电泳仪问世HPCE的仪器结构电泳组成系统：电极槽、电极、高压电源进样系统：样品池分离系统：石英毛细管（内径2575m）检测系统：检测窗、光学检测数据处理系统：电泳谱图毛细管恒温系统高压电源毛细管恒温系统检测器数据处理系统毛细管缓冲液/样品缓冲液（+ ）()毛细管电泳装置示意图电极槽铂电极铂电极HPCE基本结构电极：铂电极进样方式：样品池置换进样品的电极槽采用电动进样或压力进样方式导入分离：各组分淌度不同，在毛细管中迁 移速度不同分离HPCE与HPLC比较共同点：液相分离技术分离机理不同两者可以互为补充HPCEHPLC 分离柱毛细细管色谱谱柱 柱效更高高 分离选择选择 性更高高 分析速度更快快 样样品用量低100倍微量 流动动相溶液缓缓冲甲醇、乙腈腈等 溶剂剂消耗几乎不消耗消耗量大 高压输压输 液系统统无有 成本低高 方法成熟待完善 灵敏度较较高高 线线性范围围稍窄宽宽HPCE应用不仅用于生物大分子的分离分析也用于氨基酸、手性药物、维生素农药、无机离子、有机酸、染料、表面活 性剂肽和蛋白质、糖类、低聚核苷和DNA片断甚至于整个细胞和病毒粒子的分离分析毛细管电泳基本理论v = veo+ vep = (eo+ep)Ev ：离子移动速度veo：电渗流速度 eo：电渗流淌度 vep：电泳流速度 ep：电泳流淌度 E： 电场强度电泳电泳：组分在电场作用下的迁移产生的分子半径小、电荷大的离子具有较大的电 泳淌度；分子半径大、电荷小的离子具有较小的电 泳淌度。电泳淌度的差异，构成了电泳分离的基础电渗或电渗流电渗或电渗流：管内溶液在外力电场作 用下整体朝一个方向运动的现象 + + +()(+) 电渗的产生石英表面的负电荷(SiO- )水合阳离子向阴极的电渗流电渗流的特点之一具有平面流型，其电渗驱动力沿毛细管 均匀分布，电渗速度的径向分布几乎是 均匀的，不会直接引起区带扩散，分离 效率高电渗流的特点之二使所有的样品组分不管电荷大小，以同 样的方向移动。一般情况下，电渗流方 向从阳极至阴极，且电渗流速度大于电 泳速度，所以阴离子也在阴极流出合理地利用电渗流可以使阳离子、中性 分子、阴离子实现同时分离分析 ()(+)+ +- -毛细电泳中不同组分的迁移示意图电渗流的控制最基本方法：改变毛细管内壁的表面电荷改变缓冲溶液粘度改变电渗流需要通过毛细管电泳整个操作条 件的优化来实现操作条件：电场强度、缓冲液pH值、离子 强度或缓冲液浓度、温度、有机改性剂、表 面活性剂、中性亲水性聚合物、共价涂覆1. 毛细管区带电泳（CZE）2. 胶束动电毛细管色谱（MECC）3. 毛细管凝胶电泳（CGE）4. 毛细管等电聚焦（CIEF）5. 毛细管等速电泳（CITP）常用分离模式模式缓缓冲液体系分离机理CZE自由缓缓冲液离子淌度MECC胶束缓缓冲溶液疏水性/离子性 相互作用CGE凝胶缓缓冲溶液分子大小和 荷电电数目CIEF两性电电解质质等电电点CITP前导电导电 解质质、 尾随电电解质质移动动界面1. 毛细管区带电泳最基本、最广泛的分离模式。适用于所有具有不同淌度的荷电粒子的分离，但不能中性物质 及质荷比相同的组分。2. 胶束动电毛细管色谱用离子胶束溶液代替简单的缓冲溶液，使中性组分可按 其疏水性的不同及在两相间的 分配系数的不同而分离。采用 手性分配相，可用于手性化合 物的分离。3. 毛细管凝胶电泳凝胶的网络结构对溶质具有分子筛的作用，可分离质荷 比相同但分子大小不同的组分 。在分子生物学和蛋白质化学上有着十分广泛的应用。4. 毛细管等电聚焦根据蛋白质的等电点不同而进行分离。AA AAAABB B BBBC CC CDDDDD EEEEEFFAAAABBBBCCCCDDDDEEEEFFFFpH梯度高低毛细管电泳的操作将运行缓冲液充满毛细管柱移去进样端缓冲液池，用样品池代替用电动或压力进样方式进样将进样端缓冲液放回毛细管两端加操作电压进行电泳分离分离样品迁移至检测窗检测，数据记录 和处理应用：1. 监测药物生产过程如：监测青霉素发酵液中有关物质的量HPCE条件毛细管87cm(有效长度77cm)75m(河北永年)检测波长：214nm进样：2.5psi sec操作压力：30KV(+)(-)柱温：25缓冲液：20mmol/L磷酸盐(pH7.5)青霉素发酵液的高效毛细管电泳图1. 青霉素G钠 ；2. 6-氨基青霉烷酸；3. 对羟基苯乙酸 ；4. 邻羟基苯乙酸 ；5. 苯乙酸2. 中药成分分析如：黄酮及其苷类分析HPCE条件毛细管40cm50m (Bio-Rad)检测波长：UV275nm进样：10psi sec操作压力：20KV(+)(-)柱温：20缓冲液：50mmol/L磷酸二氢钠-12.5mmol/L硼 砂(pH8.0)黄芩中6种黄酮类成分的胶束电动毛细管色谱分离图1.汉黄芩甙；2. 黄芩素；3.黄芩甙；4. 千层子素 ；5. 汉黄芩素；6.内标水杨酸；7.白杨素胶束电动毛细管电泳分离测定北 沙参中5种香豆素类成分电泳条件未涂层融硅石英毛细管(5.12 cm 75m 40 cm) ;运行缓冲液为20 mmol/L 硼砂缓冲溶液( pH 916, 含16 mmol /LSDS, 15%乙腈) 温度22 ; 压力进样5 s ( 015Psi) ;分离 电压22 kV;检测波长214 nm实验前,用011 molL - 1的氢氧化钠溶液 冲洗北沙参供试品溶液的毛细管电泳图1. 补骨脂素; 2. 花椒毒素; 3. 异茴芹内酯; 4. 佛手柑内酯; 5. 东莨菪内酯。复方生脉散的毛细管电泳指纹 图谱研究利用毛细管电泳(CE)方法建立中药复方 生脉散(红参、麦冬、五味子)的指纹图谱 。采用序贯式均匀设计的方法优化CE分离 条件，确定生脉散指纹图谱电泳条件为:以pH为9.5、44 mmol/L硼砂 、34 mmol/L SDS为缓冲溶液体系，运行电压25 kV，温度25，压力进样50 mbar100 s，检测波长200 nm。生脉散CE指纹图谱(20个主要共有峰， 峰16-五味子醇甲，峰19-五味子乙素)11批生脉散CE指纹图谱11批生脉散CE指纹图谱中确认了20个主 要的共有指纹峰，其中4个峰来自红参， 6个峰来自麦冬，13个峰来自五味子，3 个峰为红参和麦冬共有，1个峰为麦冬和 五味子共有，另外1个为新成分。3. 手性拆分4. 体内分析