1高同型半胱氨酸血症对球囊损伤大鼠颈动脉核转录因子 NF作者：徐会圃，刘长梅，冯义柏 【关键词】 ,甲硫氨酸Effect of homocysteine on expressions of NFB and protooncogene in ballooninjured rat carotid arteries【Abstract】 AIM: To study the effect of homocysteine (Hcy) on the expressions of nuclear factorB (NFB) P65 protein and cfos, cjun mRNA in common carotid artery of rats after balloon injury and to explore the possible mechanism by which homocysteine exacerbates neointimal hyperplasia after angioplasty. METHODS: The expressions of NFB P65 protein and cfos and cjun mRNA were detected by Western blot and semiquantitative RTPCR respectively in the common carotid artery. RESULTS: The expressions of NFB P65 protein and cfos and cjun mRNA were significantly higher in low methionine (LM) group（1.120.13, 1.400.21, 1.430.25）（P0.05） and high methionine (HM) group（1.500.37, 21.680.27, 1.710.30） （P0.01 ）than those in control group（0.640.06, 1.100.15, 1.000.13）. The expressions of NFB P65 protein and cfos, cjun mRNA were also significant higher in HM group than those in LM group (P0.05). CONCLUSION: Homocysteine may upregulate the transcription of cfos and cjun mRNA in common carotid artery after balloon angioplasty by NFB pathway, which may be responsible for neointimal hyperplasia induced by homocysteine after angioplasty.【Keywords】 methionine; homocysteine; balloon injury; NFkappaB; protooncogenes【摘要】 目的： 观察高蛋氨酸饮食诱导的高同型半胱氨酸血症对大鼠颈动脉球囊损伤后血管组织 NFBP65蛋白和原癌基因cfos 及 cjun mRNA 表达的影响，探讨同型半胱氨酸在血管球囊损伤后新内膜过度增生中的可能机制. 方法： 采用 Western blot 及RTPCR 方法分别检测血管组织 NFBP65蛋白和 cfos 及 cjun mRNA 表达，并做半定量分析. 结果： 低、高蛋氨酸组血管组织NFBP65蛋白、cfos 及 cjun mRNA 的表达均高于对照组，分别为 1.120.13 vs 0.640.06 （P0.05 ）, 1.500.37 vs 0.640.06 (P0.01), 1.400.21 vs 1.100.15 （P0.05）, 31.430.25 vs 1.100.15 （P0.01）及 1.680.27 vs 1.000.13 （P0.05）, 1.710.30 vs 1.000.13 （P0.01）,高蛋氨酸组也明显高于低蛋氨酸组 (P0.05). 结论：同型半胱氨酸有可能通过 NFB通路上调血管内皮损伤后动脉组织原癌基因 cfos 及 cjun mRNA 的表达，这可能是其促进血管内皮球囊损伤后新内膜过度增生的机制之一.【关键词】 甲硫氨酸；同型半胱氨酸；球囊损伤；原癌基因；NFB0 引言实验研究和临床观察表明，血中同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)升高可引起动脉粥样硬化和血栓形成1-2. 然而其在血管内皮球囊损伤后新内膜增生中的作用及其机制尚不清楚. 我们用高蛋氨酸（methionine）饮食诱导高同型半胱氨酸血症，观察其对血管内皮球囊损伤后血管组织 NFB P65 蛋白及原癌基因表达的影响，以探讨 Hcy 促进血管内皮球囊损伤后新内膜过度增生的可能机制.1 材料和方法41.1 材料健康雄性 12 wk SD 大鼠 30 只(华中科技大学同济医学院动物中心提供)，体质量 280320 g，随机分为对照组（C）(给普通饲料)，低蛋氨酸组 (LM)(含蛋氨酸 12 g/kg 饮食),高蛋氨酸组(HM)（含蛋氨酸 20 g/kg 饮食） ，每组 10 只，各组均自由进食. 蛋氨酸(北京中山生物技术有限公司，化学纯，批号： 1903001)，总RNA 提取试剂(Trizol)及逆转录试剂盒为 Giblo 公司产品，TaqDNA 聚合酶 cfos, cjun 及内参 actin上、下游引物为 TaKaRa大连宝生物工程有限公司产品；兔抗大鼠 NFB P65 多克隆抗体、Western blot 检测试剂盒均购自武汉博士德公司. 自制 2F 球囊导管购自天津乳胶制品厂；PCR 扩增仪(美国 MJPC150 公司)，图像分析仪为上海四星公司产品. 高效液相色谱仪(美国 water 公司).1.2 方法1.2.1 动物模型建立及标本采集动物喂养 4 wk 后，体质量(350400) g,禁食 12 h，用 30 g/L 戊巴比妥钠注射麻醉(30 mg/kg, ip). 沿颈前正中线切开皮肤，在颈前三角区暴露左右颈内、外及颈总动脉，结扎左颈外动脉的远心端，用微动脉夹夹住左颈总动脉的近心端及左颈内动脉，切开左颈外动脉的近心端，然后将自制 2F 球囊导管自颈外动脉的近心端插入颈总动脉至起始部，球囊注5入生理盐水，使其充分扩张致有轻度阻力感，然后回拉球囊使球囊达颈动脉分叉处，重复 3 次，完成后负压回抽球囊中的生理盐水，取出球囊导管，结扎左颈外动脉. 以右侧颈总动脉作为正常对照，只分离血管但不做球囊损伤. 术后 1 h，每只动物心脏采血 2 mL,立即 3000 r/min 离心 15 min，-20冻存待测. 然后脊椎脱臼法处死动物，并立即取左右颈总动脉液氮冻存备用.1.2.2 血浆同型半胱氨酸及蛋氨酸测定每只动物采血 2 mL,置于 20 g/L EDTANa2 的试管中，混匀，30 min 内，标本于 4用3000 r/min 离心 15 min，分离出的血浆移入相应的 EP 管，-20冻存，留做血浆 Hcy 和蛋氨酸检测，血浆 Hcy 检测按文献3的方法稍作改良，采用高效液相色谱仪测定血浆 Hcy 水平，所用试剂批内变异系数5%,批间变异系数10%. 血浆蛋氨酸测定应用日立 83550 全自动氨基酸分析仪，采用阳离子交换树脂、分离和茚三酮显色等方法测定.1.2.3Western blot 法检测血管组织 NFBP65蛋白的表达参照博士德公司提供的蛋白提取方法,用缓冲液裂解颈总动脉组织得到组织总蛋白. 以牛血清蛋白作为标准品, 根据蛋白定量试剂盒的说明绘制蛋白定量标准曲线,于紫外分光光度计 750 nm 下测光密度值,计算蛋白提取液的浓度. 将优化表达的 NFB P65 蛋白用 100 g/L6聚丙烯凝胶电泳分离后电转移至硝酸纤维素膜上,封闭后,先加兔抗鼠NFB（P65）多克隆抗体（1500）, 再加辣根过氧化物酶结合的驴抗兔多克隆抗体(1500), 用化学发光法显影，用图像分析系统测定吸光光度值，NFB P65 蛋白的表达量以光密度的相对比值表示.1.2.4cfos, cjun mRNA 表达的检测 引物序列如下： cfos上游： 5TCCCAGAGGAGATGTCTGTG3,下游： 5GGCTCCAGCTCTGTGACCAT3，扩增片段 331 bp. Cjun 上游： 5GCCTGCACAGTGAGCCTCCG3下游： 5AGTTGGCACCCACTGTTAAC3 扩增片段 490 bp. actin上游：5CCTAAGGCCAACCGTAAAG3下游: 5TCTTCATGGTGCTAGGAGCCA3,扩增片段 623 bp. 总 RNA抽提和 cDNA 第一链的合成： 用 Trizol 试剂抽提左右颈总动脉组织总 RNA，各 RNA 样本 A260 nm/A280 nm 的比值均在 1.82.0之间，用逆转录试剂盒合成 cDNA 第一链. PCR 反应条件： 目标基因反应条件如下，94预变性 2 min，进入 PCR 循环： 94 30 s, 55 30 s, 72 40 s,共 35 个循环，结束前 72延伸 7 min;内参反应条件： 94预变性 2 min, 94 20 s, 62 30 s, 72 30 s;共 28 个循环，结束前 72延伸 7 min. PCR 产物经 20 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，用生物凝胶电泳图象分析系统对电泳条带进行灰度积分，并以 actin校正.7统计学处理： 所有数据以 xs 表示，组间比较采用方差分析和 SNKq 检验，统计处理用 SPSS 统计软件，P0.05 为有统计学意义. 2 结果蛋氨酸组血浆蛋氨酸和同型半胱氨酸浓度均显著高于对照组(P0.01),低、高两组之间也有明显差异（P0.05，表 1）. 低及高蛋氨酸组 NFB P65 蛋白表达与对照组比较有显著差异（P0.05, P0.01）, 低高两组之间差异也有显著性（P0.05，表 2)；右颈总动脉组织有微弱表达（0.130.03). 低蛋氨酸组及高蛋氨酸组 cfos 及 cjun mRNA 的表达与对照组比有明显差异(P0.05, P0.01),低蛋氨酸组与高蛋氨酸组相比也有显著差异(P0.05) （表 1，图 1A, B, C)； 右颈总动脉组织 cfos 及 cjun mRNA 仅有微弱表达，分别为 0.580.07 和0.490.06(图 1A, B, C).表 1 各组喂养 4 wk 后血浆蛋氨酸和 Hcy水平比较(略 ) 表 2 各组血管组织 NFB P65 蛋白和 cfos, cjun mRNA 表达的比较（略）3 讨论我们的实验结果表明短期给予高蛋氨酸饮食，不仅可以引起高蛋氨酸血症，而且可引起高 Hcy 血症. Hcy 在动脉粥样硬化中的8作用已得到大量文献资料的认可；最近研究发现高 Hcy 血症加重了球囊损伤大鼠颈动脉新内膜的增生4 ，但其在血管内皮球囊损伤后新内膜过度增生中的具体机制，目前尚不清楚.研究表明，血管内皮球囊损伤后的早期，血管壁组织原癌基因 cfos 及 cjun 的表达即明显上调5 ，在 1 h 左右达高峰. 我们的实验结果表明在血管内皮球囊损伤后 1 h 处死动物，在对照、低蛋氨酸及高蛋氨酸组 cfos, cjun mRNA 的表达均明显高于右侧颈