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植物组织石蜡切片的制作 一、实验目的 1熟练掌握石蜡切片的方法。 2掌握永久制片的制作过程,为研究植 物的内部结构奠定基础。 3学会植物内部结构的比较研究方法。 二、实验器具与试剂 1器具 石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养 皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖 玻片等。 2试剂 10%番红水溶液、0.5%固绿(用95%的酒精配 制)、酒精(100%、95%、80%、70%、50% )、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 三、实验材料 幼嫩植物各部分,根据季节选择材料。 四、实验内容与方法 石蜡切片法是显微技术上最重要、最常 用的一种方法。它是把材料封埋在石蜡 里面,用旋转切片机切片,可以切出很 薄的切片。凡是精细的工结构,大都用 石蜡切片。全都过程如下: 1固定 2洗涤 3脱水与硬化 4脱酒 精 2封埋 6切片 7粘片 8脱蜡 9 染色 10脱水 11. 透明 12胶封 实验二 1、石蜡切片技术固定、染色 一、实验目的: 掌握制作石蜡切片中固定、染色、返蓝 的基本操作技术 二、实验原理: 石蜡切片法:是用石蜡浸透到组织中, 并包埋组织,然后用旋转切片机将蜡块 切成切片。只是切片中最常用的一种方 法。 三、实验用品: 1实验材料:瓜叶菊叶柄,长寿花幼茎。 2实验试剂:卡诺固定液、FAA固定液、35% 酒精、50%酒精、70%酒精、83%酒精、95%酒 精、100%酒精、二甲苯、中性树胶、2% 氨水 、爱氏苏木精染液。 3实验器具:解剖器,双面刀片,青霉素小 瓶。 四、实验步骤: 1取材:依据生物组织取材的各项注意 事项。 2固定:卡诺固定液、FAA固定液固定 24小时。 3复水:卡诺固定液(1h)50%酒精 (1h)爱氏苏木精染液 FAA固定液爱氏苏木精染液 4染色(整染):爱氏苏木精染液染色 ,染色时间视材料不同而有所不同,总 之使材料最后染指红棕色为止,且内外 均染色均匀。对于染不好的材料,可加 长染色时间,还可通过负压,超声波加 注浸剂等方法提高染色效率。时间为1-2 天。 5返蓝:染好的材料,用自来水冲洗, 加2% 氨水使材料变为蓝色,时间也因材 料的不同而有所不同,好返蓝的材料用 水一洗就蓝。 附:分染:番红与固绿色法 番红用l的水溶液,固绿用0.5的酒精 液(用95的酒精配制),染色步骤如下: 讨论和注意点: (1) 用番红和固绿这个组合染成的切片,木化 、栓化和角质的细胞壁,被番红染成鲜红色, 纤维素的细胞璧,被固绿成绿色。就维管束来 讲,木质部染红,韧皮部染绿,区别极清楚。 (2) 在50酒精中脱色,需经实践,如脱色不 够,绿色难得染好,脱色太过分,做出来的切 片,红色太淡,甚至于全是绿色,失掉了二色 染法的用意。 实验二 2、石蜡切片技术脱水、透明 、浸蜡、包埋 一、实验目的: 掌握制作石蜡切片中脱水、透明、浸蜡 、包埋的基本操作技术。 二、实验用品: 1实验试剂:35%酒精、50%酒精、 70%酒精、83%酒精、95%酒精、100%酒 精、二甲苯、石蜡。 2实验器具:电光纸、电热恒温箱、烤 片机、解剖器、盆。 三、实验步骤: 1脱水:35%酒精50%酒精70%酒精 83%酒精95%酒精100%酒精100%酒精 。每级1-2h。70%酒精处可长期保存。 2透明:1/2二甲苯+1/2100%酒精 (1-2h) 纯 二甲苯(1h) 纯二甲苯(1h) 3浸蜡:石蜡先置于60的温箱中,倒入含 二甲苯及材料的小瓶中置于38温箱中,放置 2-4小时。 4包埋:先提升恒温箱的温度至60, 换纯蜡3次,每次1-2h,用硬的电光纸、 牛皮纸叠纸盒,置于45-60的烫板上, 倒入材料,摆放好材料,把标签(正面 向外置于底部),补足石蜡,倒好后轻 轻的置于冷水盆中,注意底面要接触盆 中凉水,待石蜡全部凝固后可取出晾干 ,也可在凉水盆中放置过夜。 实验二 3、石蜡切片技术切片、粘片、 脱蜡、透明、封藏 一、实验目的: 掌握制作石蜡切片中切片、粘片、脱蜡、透明 、封藏的基本操作技术。 二、实验用品: 1实验试剂: 95%酒精、100%酒精、二甲苯 、蒸馏水、加拿大树胶。 2实验器具:切片机、烤片机、解剖器、载 玻片、盖玻片、酒精灯、木筷、染色缸。 三、实验步骤: 1修块、粘块、整修的步骤: 选取所要切片的材料,从包埋的石蜡块上用 单面刀片切割下来,注意不可损伤包埋的组织 。 确定切面的方位,用刀片将石蜡块的四面作 初步的整修。保证材料四周都有石蜡包围。但 不可太多。切面的上、下边平行。 点燃酒精灯,并准备一把旧的解剖刀 。 左手大拇指与食指间持整修好的石蜡 块,材料向上用其余三指夹住台木。此 时将解剖刀在酒精灯上加温后,即放在 台木与石蜡块之间,因解剖刀已加温, 遇上两面的石蜡都会融化,可立即将解 剖刀抽出,石蜡块迅速压在台木上。 再将解剖刀蘸取少许石蜡碎屑,放在 刚才固定的石蜡四周。此时,解剖刀再 加温,并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平 。使石蜡块牢固地粘在台木上。 修石蜡块上下面平行,是切成的蜡带 呈一直线,不弯曲。每个切片中组织的 距离接近。 2切片的方法: 准备下列用具:毛笔、黑色亮光纸 将已固着和整修好的石蜡块和台木装 在切片机的夹物部分. 安装切片刀,将刀片夹在刀夹上,并调整好 刀的角度。刀的斜度,非常重要,最好先切除 的蜡块试刀,以确定刀的斜度,一经调度适合 后,就不要随便变动,以免每次试刀的麻烦。 移动刀片固定器,使夹刀部与夹物部之间的 距离调整好,以石蜡块的表面刚贴近刀口为度 ,在旋紧切片固定器的螺旋。 调整石蜡块与刀口之间的角度与位置 。修整蜡块,将刀片移近蜡块,使小蜡 块的下边与刀锋平行,如不平行,可调 夹物部上的螺旋。然后把它固定,再转 下蜡块呈矩形才行。只有平整的蜡块 ,才能切出平整的蜡带。 最后根据需要,调整控制切片厚度的机 制。调度后,把它固定下来。上述四步 骤完成后,就可进行切片, 开始切片。右手握旋转轮的手柄,摇 动一转就可切下一片,切下的蜡片粘在 刀口上,待第二片切下时粘在一起,所 以连续摇动就可将切下的蜡片连成一条 蜡带。这时左手就可持毛笔将蜡带提起 ,边摇边移动蜡带。转速为每分钟40-50 为宜。 切成的蜡带到20-30厘米时,即以右手 用另一只毛笔轻轻将蜡带挑起,平放在 黑电光纸上。靠刀的一面较光滑,应向 下,较皱的一面向上。 切下的蜡片是否良好,此时应先行检 查。 切片工作结束后,仍将刀片用具擦拭 干净。 3贴片:贴附牢固,在染色时不易脱落 ;是皱褶的蜡片伸展平整。 用具:载玻片、粘片剂、解剖刀、蒸馏 水、展片机及铐片机。 材料切成薄片后,须将切片粘在玻璃片上,加 热展开,这叫粘片。 所用载玻片必须清洁才能使用。粘片时,需把 胶液(或称粘贴剂)置簿玻片上,再取切片,浮 置胶液上,然后置烘片台上,使切片展开烫平 ,材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好, 用滤纸吸去多余水分,同时以记号笔在玻片上 编号,放入温箱中烘干,温度3040约1小 时即干。常用的胶液有下列三种: (1) 明胶液:这是粘片最常用的胶液,简便优良,配法 是100毫升纯水中,加明胶4毫克,加热熔化,过滤即 得。 (2) 梅氏蛋白质: 鸡蛋清 50ml 甘 油 50m1 水杨酸纳 1g 用蛋白与甘油搅拌,同时加入水杨酸纳,调匀过滤, 应用时以滤液15滴,放入纯水50毫升中即得。 (3) Land氏液: 阿拉伯胶 1克 重铬酸钾 0.2克 纯 水 100毫升方法 将展片机温度调整到35,保持恒定。 在载玻片上涂蛋白甘油粘片剂。其法是用细 玻璃棒蘸取一小滴粘片剂,加在载玻片的中央 ,然后用洗净的手指(无名指)加以涂抹,范 围不要太广,也不要太多,以能贴足够的蜡片 为度。蛋白甘油粘片剂的配方:(不适宜用作 蛋白观察) 将涂粘片剂的载玻片放在展片机上, 滴加蒸馏水数滴,此时若发现水不均匀 分散而聚成滴状,即表示玻片不清洁, 有残留油脂等物在上面。 用解剖刀将蜡带切成小段,每段的长 度应以盖玻片的长度为准,一般应比盖 玻片短约1/5-2/5。分片应从蜡带交界处 分。 将蜡带轻轻移到涂有水的载玻片上,蜡 片光面应向下贴在载玻片上,依次排列 整齐。留出右端贴标签处。 材料展平后,从展片机上取下,稍稍 倾斜留出多余的水分,用吸水纸吸干背 面及周围多余水分,放于烤片机(35 )上烤干水分。 4.脱蜡:玻片烘干后,须将蜡脱去,才能 染色,脱蜡用二甲苯,把烤好的载玻片 放于盛二甲苯的染缸中纯二甲苯(5- 10min) 纯二甲苯(5-10min) 若分染需再经酒精入水中,而后染色, 其顺序如下: 二甲苯1/2 二甲苯十1/2纯酒精100% 酒精95酒精85酒精70酒精 50酒精30酒精水染色 以上各级约需510分钟。 5.滴加加拿大树胶封藏。 6镜检:石蜡切片的异常及处理 一张理想佳良的切片,除组织固定适当 和染色清晰之外,还应具备:薄、平整 ,无皱褶压缩,无裂损抓迹及擦痕,同 时贴片排列密集,整齐位置适当,透明 度好,封片用胶适量,盖玻片端正,无 气泡等。 石蜡切片中的异常及原因和处理 方法 注:切制石蜡切片遇到障碍大多数 是:(1)刀钝或刀刃受损。(2)蜡块 或切片刀的调整螺旋或是紧固螺旋拧不 紧。因此,有经验的切片者在开始切制 切片之前应习惯地反复核查(1)(2) 这两点。
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