1高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素的含量作者：陈云华,赵晓霞, 王文全,段天璇【摘要 】 目的 建立同时测定甘草中甘草酸、甘草苷和异甘草素含量的方法。方法 采用高效液相色谱法对甘草粉末的 67%甲醇提取物进行分析。用 C18 反相色谱柱,1%磷酸水-乙腈梯度洗脱,对不同色谱峰分别采用 248、276 、360、370 nm 紫外波长检测。结果 甘草酸的回归方程为 Y1106X16 220,r21；甘草苷的回归方程为 Y2106X49 444,r20.999 5；异甘草素的回归方程为Y 1107X4.466 7,r21。甘草酸、甘草苷和异甘草素的加样回收率分别为 98.01%、 102.63%、98.18% 。结论 本方法准确、稳定、可靠,可用于甘草中甘草酸、甘草苷和异甘草素 3 种成分的同时测定。 【关键词】 甘草；甘草酸；甘草苷；异甘草素；高效液相色谱法；含量测定Abstract：Objective To develop a HPLC quantitatively test method of glycyrrhizin, liquiritin and isoliquritigenin simultaneously for licorice. Methods The 67% methanol 2extracts of licorice powder were analyzed by reverse-phase HPLC on an ODS column, using a gradient elution with a mixture of 1% H3PO4 and acetonitrile. The eluate was monitored by UV absorption at 248, 276, 360 and 370 nm. Results The linear equation of glycyrrhizin was Y 1106X16 220, r21. The linear equation of liquiritin was Y2106X49 444, r20.999 5. The linear equation of isoliquritigenin was Y1107X4.466 7, r21. The recovery rate of glycyrrhizin, liquiritin and isoliquritigenin was 98.01%, 102.63% and 98.18% respectively. Conclusion The method is accurate, stable amd reliable, and can be used to determine the three main chemical contents simultaneously.Key words：Licorice；glycyrrhizin；liquiritin；isoliquritigenin；HPLC；content determination在甘草质量研究中,建立稳定可靠的甘草多种成分含量测定非常必要。甘草酸、甘草苷、异甘草素是甘草中代表性成分,甘草酸是皂苷类代表,甘草苷是黄酮类代表, 而异甘草素是一种异黄酮类成分。我们此次在以往工作的基础上1,完善了甘草含量测定方法,使其同时可以对甘草酸、甘草苷、异甘草素进行含量测定。31 仪器与试药Agilent 1100 型高效液相色谱仪(配有 G1314A 紫外检测器、1315B DAD 检测器、 G1311A 四元梯度泵、G1322A 在线脱气装置、G1316A 柱温箱)；Agilent 1100 化学工作站；Sartorius BS110S 1/万、BP211D 1/(10 万)电子分析天平；KL3120D 超声清洗机。甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 3 年生采自甘肃总寨,15 年生采自内蒙古杭锦旗,由北京中医药大学王文全教授鉴定。60 干燥过夜并粉碎。甘草酸、甘草苷、异甘草素对照品(批号分别为 060520、061009、060801)由上海康九化工公司提供(供含量测定用) 。乙腈为色谱纯；水为市售娃哈哈纯净水；甲醇、甲酸、磷酸、冰醋酸为分析纯。2 方法与结果2.1 检测波长的确定分别称取甘草酸、甘草苷、异甘草素对照品适量,分别加甲醇配制成每 1 mL 约含 0.1 mg 的对照品溶液。以甲醇为空白,在波长4190 400 nm 范围内扫描,结果甘草酸的最大吸收波长为 248 nm和 360 nm,甘草苷的最大吸收波长为 276 nm,而异甘草素的最大吸收波长为 370 nm。2.2 色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax Extend 分析柱(4.6 mm250 mm,5 m)；柱温：25 ；进行梯度洗脱, 流动相 A 为 1%磷酸水溶液,流动相 B 为乙腈；梯度程序、流速及检测波长变化见表 1。进样量为10 L。表 1 流动相梯度条件及检测波长（略）2.3 供试品溶液的制备精密称取甘草粉末(过 60 目筛,60 干燥 12 h)0.1 g,置 25 mL容量瓶中,加入 20 mL 67%甲醇冷浸 24 h,超声 30 min,放至室温,加67%甲醇至刻度,摇匀, 以 0.45 m 微孔滤膜滤过,取续滤液即得。2.4 工作曲线称取甘草苷对照品 6.28 mg、甘草酸对照品 5.99 mg,分别用甲醇定容于 25 mL 容量瓶中, 作为甘草苷和甘草酸对照品储备液。另取异甘草素对照品 4.35 mg,置 25 mL 容量瓶中,以甲醇溶解并稀释至刻度, 再精密吸取 0.4 mL 置 10 mL 量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得5异甘草素储备液。分别精密吸取甘草苷储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 、3.0 mL,甘草酸储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 、6.0 mL,异甘草素储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 、0.6 mL,置 6 个 10 mL 容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,作为系列混合标准溶液。分别进样 20 L,记录甘草苷、甘草酸和异甘草素的峰面积。以峰面积对进样量(g)进行回归,得回归方程。甘草酸：Y1106X16 220,r21；甘草苷：Y 2106X49 444,r20.999 5；异甘草素：Y 1107X4.466 7,r21 。色谱图见图 1。甘草苷、甘草酸、异甘草素色谱峰理论塔板数分别为 4 万、14 万和 21 万。2.5 精密度试验取上述混合标准溶液,连续进样 6 次,结果甘草酸、甘草苷、异甘草素的峰面积 RSD 分别为 0.65%、0.35%、0.40%, 表明精密度符合要求。2.6 稳定性试验取甘肃总寨甘草样品 1 份, 按“2.3”项下方法制备供试品溶液,室温放置并于 0、2、4、6 、8、10 h 进样,记录色谱图,代表性色谱图如图 2。故以甘草酸、甘草苷和异甘草素三者的峰面积计算 10 h 的6稳定性。结果甘草酸、甘草苷、异甘草素峰面积 RSD 分别为0.29%、0.49%、0.85%,表明甘草供试品在 10 h 内稳定。2.7 重复性试验取甘肃总寨甘草样品 6 份, 每份 0.1 g,精密称定,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,依法测定, 结果甘草酸、甘草苷和异甘草素的峰面积 RSD 分别为 2.15%、2.10%、2.63%,表明本法重复性好。2.8 加样回收率试验称取甘草苷对照品适量,加甲醇制备成每 1 mL 含 0.663 mg的对照品溶液；称取甘草酸对照品适量,加甲醇制备成每 1 mL 含0.611 5 mg 的对照品溶液；取甘肃总寨甘草样品 6 份,每份 0.05 g,精密称定,分别置 6 个 25 mL 容量瓶内, 分别加入上述甘草苷对照品溶液 2 mL、甘草酸对照品溶液 4 mL、 “2.3”项中的异甘草素储备液 1 mL,再分别按照 “2.3”项下方法制备得供试品溶液,依法试验,记录甘草苷、甘草酸和异甘草素的峰面积,并计算加样回收率,结果加样回收率符合规定。结果见表 2。表 2 甘草酸、甘草苷、异甘草素的加样回收率试验结果(略)2.9 样品测定7按上述色谱条件, 依法测定了内蒙古杭锦旗 15 年生栽培甘草样本中甘草酸、甘草苷和异甘草素的含量,结果见表 3。表 3 杭锦旗栽培甘草不同年限 3 种成分的含量测定结果 (略)3 讨论由以上试验结果可知,本法线性良好,精密度、稳定性好,重复性和加样回收符合规定,可以作为甘草中甘草苷、甘草酸和异甘草素同时测定的方法。前期在提取溶剂的选择过程中考察过 80%氨性甲醇、80%氨性甲醇提取并酸化后定容、80%甲醇(大部分测定甘草黄酮文献采用的提取溶剂)、67%甲醇2005 年版中华人民共和国药典 ( 一部)测定甘草酸的基本提取溶剂、甲醇-0.2 mo1/L 醋酸铵- 冰醋酸(67331)2005 年版中华人民共和国药典(一部)测定甘草酸的提取溶剂、70%乙醇2005 年版中华人民共和国药典 ( 一部)测定甘草苷的提取溶剂、50%乙醇( 日本、美国药典测定甘草酸的提取溶剂)。结果表明, 除 2 种氨性甲醇系统外 ,5 种溶剂对各共有成分提取效果近似,综合考虑甘草苷、甘草酸和几个主要共有成分,67%甲醇综合提取效果相对略好,且对甘草苷、甘草酸提取效果分别好于药典相应提取条件2。8以本法测定内蒙古杭锦旗甘草样品显示,不同年限甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素存在着一定的差异。【参考文献】1 段天璇,于密密 ,刘春生,等.HPLC 法同时测定甘草指纹图谱暨甘草苷、甘草酸含量J.中成药,2006,28(2)：161165.2 闫永红.不同来源甘草的质量特征及评价研究D.北京中医药大学博士研究生学位论文.北京.2006.2247.