1高效液相色谱法测定人血浆中依诺沙星含量及药动学研究作者：孙亚欣 丁艳萍 何晓静 肇丽梅 【摘要 】 目的 建立测定人血浆中依诺沙星浓度的高效液相色谱方法。方法 血浆样品经甲醇沉淀蛋白后，以乙腈0.05mol/L 柠檬酸缓冲液(1585，pH3.5)为流动相，经 HypersilBDS C18(4.6mm150mm，5m)色谱柱分离， 345nm 波长检测。结果 依诺沙星在 0.055.0g/ml 浓度范围内线性关系良好，低、中、高三个浓度的提取回收率为 44.8%51.1%，日内、日间相对标准差为 3.15%6.61%。结论 本方法准确、快速，可满足临床药动学研究的要求。 【关键词】 依诺沙星 高效液相色谱法 药动学Determination of enoxacin in human plasma byABSTRACT Objective An HPLC method was established for determination of enoxacin in human serum. Methods Serum protein was precipitated with methanol. The analysis was 2conducted with a HypersilBDS C18 (4.6 mm150 mm, 5m) column, acetonitrile0.05 mol/L citric buffer (1585, pH3.5) as mobile phase, and the detecting wavelengh was at 345 nm. Results The linear range enoxacin was 0.055.0 g/ml and the recoveries were in the range of 44.8%51.1% at three different concentrations. The RSD of intra and interday were in the range of 3.15%6.61%. Conclusion This method is suitable for the pharmacokinetic study of enoxacin.KEY WORDS Enoxacin; HPLC; Pharmacokinetics依诺沙星又名氟啶酸，是第三代喹诺酮类广谱抗生素，通过作用于细菌 DNA 螺旋酶，抑制细菌 DNA 的合成和复制而导致细菌死亡。临床上用于敏感菌所致的急性呼吸系统、泌尿系统、消化道及皮肤软组织等感染的治疗1 。有关依诺沙星浓度测定的方法国内、外都有报道，有采用 LC/MS/MS 法2 、荧光法3 、微生物法4 、微透析法5 ，常用 HPLC 紫外检测6，7 。本文建立了测定血浆中依诺沙星的高效液相色谱法，该方法简便，快捷，并研究了该药的体内药动学行为，为临床研究提供方法和依据。1 仪器与试药3HP1100 系列高效液相色谱仪(Agilent 公司)，GL20GII 高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂) 。依诺沙星对照品( 含量99.7%，山东罗欣药业股份有限公司提供)；依诺沙星片 (山东新华制药股份有限产品，规格为每片 200mg，批号 0501084)。甲硝唑对照品(内标物，中国药品生物制品检定所) ；乙腈、甲醇为色谱纯；柠檬酸和三乙胺均为分析纯。空白血浆由中国医科大学附属二院输血科提供。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱为 HypersilBDS C18 柱(4.6mm150mm，5m)；流动相为乙腈柠檬酸缓冲液 (1585，pH3.5)(缓冲盐为每 1000ml溶液加三乙胺 6ml 调至 pH3.5)；流速 1.0ml/min；检测波长345nm；柱温 30。2.2 血浆样品处理取血浆样品 0.5ml，于具塞塑料离心管中，补加 50l 甲醇，加入内标(10g/ml 甲硝唑甲醇溶液 )50l，加甲醇 1.0ml 涡旋混合1min，10000r/min 离心 10min，移取上清液于另一洁净试管中，455氮气吹干上清，200l 甲醇溶解残渣，取 20l 上清液进样，记录色谱图。2.3 标准曲线取 0.5ml 空白血浆，依次加入浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0 和 50.0g/ml 的依诺沙星标准系列的甲醇溶液 50l，配制相当于 0.05、0.10、0.25、0.50、1.0 、2.5和 5.0g/ml 的血浆样品，按“2.2”项下的方法操作，制备标准曲线。以待测物浓度 C 为横坐标，待测物与内标物的峰面积比(Y)为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，得直线回归方程：Y=0.8612C-0.00047 r=0.9977(n=3)2.4 方法专属性考察在上述色谱条件下测得空白血浆、空白血浆加入标准品及实测血浆样品的谱图(Fig.1)。在本实验条件下依诺沙星的保留时间约为3.05min，内标甲硝唑保留时间约为 4.48min，血浆内源性物质对依诺沙星及甲硝唑无干扰。2.5 方法精密度和回收率5制备浓度分别为 0.1、0.5 和 2.5g/ml 的依诺沙星标准血浆样品作为质控(QC)样品，按“2.2” 项下依法操作，每个浓度 6 个样本，连续测定 3d，以当日的标准曲线计算样品的测得浓度，与配制的浓度对照，求得本法的精密度与准确度。另取相当于 0.1、0.5 和2.5g/ml 的标准品稀释液，进样 20l，记录峰面积，考察提取回收率。结果见 Tab.1。2.6 稳定性考察按 “2.5”项下方法分别配制低、中、高三个浓度 QC 样品，每个浓度进行 6 样本分析经提取，室温放置 24h 测定，结果 RSD3%，表明血浆样品室温放置 24h 稳定。同法配制低、中、高三个浓度的QC 样品，经反复三次-20冰冻，室温融化后测定样品浓度，结果RSD 5%，表明血浆样品在冻融条件下稳定。2.7 药动学研究A: Blank plasma; B: Plasma with standard material (2.5 g/ml);C: Plasma sample 1.5h after a single dose 1: Enoxacin; 2: IS6经医学伦理委员会批准，选择健康男性志愿者 20 名，平均年龄(22.40.8)岁，平均身高(1.730.05)m，平均体重(65.44.57)kg，试验前体格检查心电图、肝、肾功能等各项指标均为正常。由本人签署知情同意书。试验日晨空腹服用依诺沙星片 400mg，分别于给药前和给药后0.33、0.67、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 、6.0、9.0、12.0 和 24.0h取静脉血 4ml，置肝素离心管中，离心、分离血浆，按 “2.2”项下方法操作，测定血浆中依诺沙星的浓度，主要药动学参数tmax、cmax、t1/2 和 AUC 分别为(1.290.59)h、(3.470.84)g/ml、(7.231.20)h 和(21.54.23)gh/ml。平均药时曲线见Fig.2。3 讨论依诺沙星的标准品溶液经紫外扫描，最大吸收波长分别在 274和 345nm，在实际测定中我们采用 345nm，虽然没有 274nm 处响应值高，在实验条件下血浆内源性杂质对样品和内标无干扰，且可满足体内样品分析测定的需要。本试验优化了不同提取液、流动相，发现流动相在 pH3.5 的条件下分析依诺沙星和内标可得到很好的分离，且峰形对称。采用有机溶剂提取、酸沉的方法均有内源性干扰，而采用甲醇和乙腈直接7沉淀蛋白的方法无内源性干扰，用甲醇提取回收率相对要高，虽然回收率仅为 50%左右，但高、中、低三个浓度下的提取回收率非常一致，提取物室温放置稳定，且无内源性杂质干扰，重现性好。每个样品的分析时间仅为 5min，适合本文所获得的药动学参数与国内外文献8，9报道一致，为该药临床安全有效的应用及个体化给药提供了参考依据。本文所用的方法准确、灵敏、快速，适用于药动学研究。【参考文献】 1 Henwood J M, Monk J P. Enoxacin. A review of its antibacterial activity, pharmacokinetic properties and therapeutic use J. Drugs,1988,36(1):322 周虹. LC/MS/MS 法同时测定食品中喹诺酮类药物J. 口岸卫生控制，2005，10(3)：40 3 EspinosaMansilla A, Pena A M, Gomez D G, et al. HPLC determination of enoxacin, ciprofloxacin, norfloxacin and ofloxacin with photoinduced fluorimetric (PIF) detection 8and multiemission scanning application to urine and serum J. J Chromatogr B,2005,822:1854 张莉蓉，乔海灵，王海学. 依诺沙星胶囊在健康人体的药物动力学及相对生物利用度J. 中国临床药学杂志，2002，11(2)：895 刘志东，李佳玮，张立波. 微渗析技术研究依诺沙星眼用缓释凝胶剂兔眼内药动学J. 中国新药杂志，2005，14(7)：8676 李彬，王海意，吴鸿范. 高效液相色谱法测定血清中依诺沙星浓度J. 天津医科大学学报，1995，1(1)：307 Davis J D, Aarons L, Houston J B. Simultaneous assay of fluoroquinolones and theophylline in plasma by highperformance liquid chromatography J. J Chromatogr,1993,621(1):1058 张菁，张婴元，任建忠，等. 国产依诺沙星片剂的生物利用度及药动学参数J. 上海医科大学学报，1994，21(5)：33999 Jaehde U, Sorgel F, Naber K G, et al. Distribution kinetics of enoxacin and its metabolite oxoenoxacin in excretory fluids of healthy volunteers J . Antimicrob Agents Chemother,1995,39(9):2092