第七章 有机介质中的酶反应Enzymatic catalysis in Non-aqueous system1Contents of chapter 6第一节 有机介质中的酶促反应概述第二节 有机介质中酶促反应的条件第三节 有机介质对酶性质的影响第四节 有机介质中酶促反应的应用GoGoGoGoGoGoGoGoGoGoGoGoGoGo2n一、酶催化反应的介质n二有机相酶反应的优点n三有机相酶反应必备条件n四有机相酶反应的研究进展第一节 有机介质中的酶促反应概述3一、酶催化反应的介质水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为 许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反 应的发生。是否存在非水介质能保证酶催化？1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应 的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类 、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体 系中进行催化反应。4（一）酶非水相催化的分类1.有机介质中的酶催化指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。 适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结 构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。2.气相介质中的酶催化酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或 者能够转化为气体的物质的酶催化反应。 由于气体介质的 密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液 中的催化作用有明显的不同特点。53.超临界介质中的酶催化酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温 度和压力超过某物质超临界点的流体。 4.离子液介质中的酶催化酶在离子液中进行的催化作用。挥发性低、稳定性好。 酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、 立体选择性、键选择性等显著特点。 离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机） 阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类。6（1）非极性有机溶剂酶悬浮体系(微水介质体系)用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机 相中。但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一 般小于2%)。酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在 固体载体表面上。（2）与水互溶的有机溶剂水单相体系有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都 能溶解在这种体系中。 （3）非极性有机溶剂水两相/多相体系由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相 所组成的两相体系。（二） 酶促反应有机介质体系 7(4) 正胶束体系正胶束是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶 剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。表面活性 剂的极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂被包在液滴内部 。反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物 在胶束内部。反应在胶束的两相界面中进行。(5)反胶束体系反胶束是指在大量与水不混溶的有机溶剂中，含有少量的 水溶液，加入表面活性剂后形成油包水的微小液滴。不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂 和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。 89二有机相酶反应的优点1.有利于疏水性底物的反应2.可提高酶的稳定性3.能催化在水中不能进行的反应4.可改变反应平衡移动方向5.可控制底物专一性6.可防止由水引起的副反应7.可扩大反应pH值的适应性。8. 酶易于实现固定化。9.酶和产物易于回收。10.可避免微生物污染。10三 有机相酶反应具备条件 1 保证必需水含量。 2 选择合适的酶及酶形式。 3 选择合适的溶剂及反应体系。 4 选择最佳pH值。11四 有机相酶反应的研究进展 1 超临界流体中的酶反应 2 仿水溶剂和印迹技术121 超临界流体中的酶反应（1）概念:指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有和 液体同样的凝聚力、溶解力；然 而其扩散系数又接近于气体，是 通常液体的近百倍。超临界流体萃取具有很高的 萃取速度。另外该流体随着温度 与压力的连续变化，对物质的萃 取具有选择性，而且萃取后分离 也很容易。13（2）超临界流体的有关性质A.超临界流体的P-V-T性质流体名称乙烷丙烷丁烷戊烷乙烯氨CO2二氧化硫水临界温度 （）32.396.9150.0296.79.9132.431.1157.6374.3临界压力 （Mpa）4.263.83.385.1211.2 87.387.2822.114.88临界密度 (g/cm3)0.2200.2280.2320.2270.23 60.4600.5250.3260.20314B. 超临界CO2指纯净的CO2被加热或压缩到高于其临界点（临界温度31.1，临界压力7.28Mpa)时的状态。该流体具有无毒、无臭、不燃等优点。对多数酶都能适用，且产物易于分离。C.提高溶剂选择性的基本原则：第一：操作温度和压力在超临界流体的临界点接近；第二：超临界流体的化学选择和待分离溶质的化学性质接近。15D. SC 流体的溶解能力超临界流体的溶解能力与其密度有很大关系，而密度 又受到体系温度或压力的明显影响，所以压力或温度的 变化，就会直接改变其溶解能力。E.超临界流体的选定 萃取剂需具有化学稳定性，对设备没有腐蚀性； 临界温度不能太低或太高，最好在室温附近或操作 温度附近； 操作温度应低于被萃取溶质的分解温度或变质温度 ；16 临界压力不能太高，可节约压缩动力费； 选择性要好，容易得到高纯度制品； 溶解度要高，可以减少溶剂的循环量； 萃取剂要容易获取，价格要便宜； 萃取剂必须对人体没有任何毒性。（在医药、食品上使 用）1718（1） 仿水溶剂体系 n原理: 酶在有机相中主要依靠必需水与酶分子间的氢键维持活性构象，因此可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的水，以调节酶分子的柔性，从而影响酶的活性和立体选择性。2 仿水溶剂和印迹技术极性添加剂对体系的影响a. 对反应体系内水的分配影响 b. 与蛋白质的直接作用 c. 对产物分配的影响19优势：利用仿水溶剂与酶形成氢键的能力，调节酶的柔性，提高酶的活力和 控制酶的选择，还可以控制由水而产生的逆反应和副反应。20（2）分子印迹技术n原理：竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。21n例： 当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2）的水溶液中冻干出来后，再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干出来的酶高100倍，但这样处理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相同。 22第二节 有机介质中酶促反应的条件n酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具 有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构 象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需 要一层水化层，以维持其完整的空间构象 必需水（essential water）。n有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显 著影响。存在最适水含量。23一必需水1.概念： 紧紧吸附在酶分子 表面，维持酶催化 活性所必需的最少 量水。 注意：酶的活性是 由必需水决定的， 与溶剂里的水含量 无关。24非水介质酶催化反应的共识n微量的水对酶有效发挥催化作用是必需的，因为水 间接或直接的参与了酶天然构想中包括氢键、静电 作用、疏水作用和范德华力在内的所有非共价相互 作用。n无水条件下，酶分子的带电基团和极性基团之间通 过相互作用形成一种非活性的“封闭”结构，水的加 入可以削弱这种相互作用，使非共活性的“封闭”结 构“疏松”，从而酶分子的柔韧性增加，并通过非共价作用力来维持酶的催化活性构象，即水充当了酶 分子的“润滑剂”。252.表征必需水作用的参数-热力学水活度n定义：在一定温度和压力下，反应体系中的水蒸汽压与相同条件下纯水的蒸气压之比。该参数直接反应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用溶剂无关。n含义：水在体系中的固相（酶，载体），液相（含底物的溶剂）和气相（液面上部的空间）之间进行分配，达 到平衡时各相水活度相等。26水活度结合在酶分 子上的水溶解在溶剂中的水气相中的水蒸气结合在其他 组分上的水27采用水活度作为结合水量的衡量有多个优点1 水活度的大小能直接反映出酶分子结合水的多少2 反微量水的低水有机溶剂体系是一个涉及含酶和 载体的固相、含底物溶剂的液相和体系空间的气 相等三相系统，可用各相的水活度相等的原则方 便的表示或处理体系的平衡状态3 可以在反应到达平衡时通过测定体系的气体湿度 比较方便的测定出水活度。283 .干燥酶的水合过程（1） 与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g（水/酶）（2） 与酶分子表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g)（3） 凝聚到酶分子表面相互作用较弱的部位（0.250.38g/g）（4） 酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。溶菌酶：294.影响酶需水量的因素a 不同酶需水量不同b. 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同溶剂疏水性越强，需水量越少（水在溶剂和酶之间分配）30n不同种类的酶因为其分子结构的不同，维持 酶具有活性的构象所必需的水量也不同，即 使同一种类的酶，由于酶的来源不同，所需 的水量也显著不同。n例，在脂肪酶催化转酯反映中，根据脂肪酶 对水的敏感程度可以分为、三种类型。3132n为对水敏感型，当体系中不加水及水活度极低时 ，酶的催化活力接近于零，随着水活度的增加，酶 的催化活性急剧上升，至最大值后，随着水的加入 ，酶的催化活性又逐渐下降。n为范围敏感型，即在很低的水活度时，酶就具有 一定的催化能力，而在最佳水活度附近，随着水活 度的变化，酶的催化活性随之发生急剧变化。n为水不敏感型，催化反应具有最佳水活度，但水 活度对酶的催化活性影响不显著，酶的催化活性不 会随水活度的改变而发生突跃式的变化。33n水的介电性高，有机溶剂中少量的“必需水”能够有效的屏蔽有机溶剂与酶蛋白表面某点之间的静电相 互作用，使酶分子构象与结晶状态一致，即与水溶 液中酶分子结构类似。n如果溶剂的极性非常强，水的介电能力不足以屏蔽 溶剂与蛋白分子之间的静电相互作用，或者溶剂的 亲水性大于酶蛋白表面的亲水性，水脱离酶蛋白而 进入有机溶剂时，酶蛋白分子的结构才会受到溶剂 的影响。345.水对催化反应速度的影响n酶在有机介质中的催化活力要比在水溶液中 低在非水介质中酶的水化作用不完全，水化 程度低的酶有较高的结构刚性，酶分子内部 流动性降低导致稳定性增加，但是结构上柔 韧性的降低导致活性降低。35n当有机溶剂中酶含水量 低于最适水含量时，酶 分子的构象过于“刚性” 而失去催化活性n加入适量的水，能使酶 活性中心的极性和柔性 提高，从而使酶活急剧 升高。n再增加含水量时，非但 不会增加酶的催化活力 ，反而会引起酶活力的 降低。水含量对酶催化速度的影响36原因n酶分子结构的柔性过大，酶的构象将向疏水环境下 热力学稳定的状态变化，引起酶分子结构的改变而 使酶失去活性。n水分子在活性位点之间形成水束，通过介电屏蔽的 作用，掩盖了活性部位的极性。n太多的水会使酶积聚成团，导致疏水性底物较难进 入酶的活性部位，引起传质阻力。37二. 酶的选择1. 酶种类的选择应具有对抗有机介质变性的潜在能力，在有机 介质中能保持其催化活性构象。（1）酶粉：例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应 ，发现催化活性随反应体系中酶量的减少而显著增加。 （）化学修饰酶：例如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、pH 、蛋白酶水解的稳定性均高于天然SOD。2酶形式的选择 38n（） 固定化酶：把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻 土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有机介质变 性的能力、反应速度、热