第10章 酶的作用机制和 酶的调节The Mechanism and Regulation of Enzyme Catalysis内容提要lEnzyme active sitelUnique characters of enzyme catalysisl Factors effecting enzyme catalysislRegulation of EnzymeslIsozymel10.1 酶的活性部位lEnzyme active sitel10.1.1 酶活性部位的特点l酶分子中直接和底物结合，并和酶催化作用直接 有关的部位称为酶的活性部位(active site)或 活性中心(active center)lThe catalytic activity of enzymes depends on the integrity of their native protein conformation. lThe primary, secondary, tertiary, and quaternary structures of protein enzymes are essential to their catalytic activity. Native stateDenatured stateunfoldin grefoldingl一般是特异的氨基酸残基比较集中的区 域，即与酶活力直接相关的区域。l活性部位又分为：l1）结合部位（Binding site） -负责与底物 的结合，决定 酶的专一性。l2）催化部位(Catalytic site) -负责催化底 物键的断裂形成新键，决定酶的催化能 力。酶的活性部位Active siteBinding siteCatalytic siteBinding siteThe enzyme Dihydrofolate Reductase with its two substrates NADP+ (red) and tetrahydrofolate (yellow)Gly216Gly226Gly216Ser189Gly226Val216Thr226Ser189Binding siteThe binding site determines the substrate specificity of the enzymeElastase 弹性蛋白酶Asp 102His 57The catalytic site of Chymotrypsin （His 57, Asp 102, Ser 195）Catalytic siteThe Active Sites of Enzymes Have Some Common Features 1. The active site takes up a relatively small part of the total volume of an enzyme. 2. The active site has three- dimensional structure which is formed by groups that come from different parts of the amino acid sequence.folding3. Active sites are clefts开裂 or crevices裂缝. 4. Substrates are bound to enzymes by multiple weak attractions.5. The specificity of binding depends on the precisely defined arrangement of atoms in an active site. l酶的活性部位的共同点：l1）活性部位通常只占整个酶分子体积的1%-l 2%。酶分子的催化部位一般只有23个氨 l 基酸残基组成。l2）酶的活性部位是一个三维实体。l3）酶的活性部位并不是和底物的形状正好互l 补的，而是在酶和底物结合的过程中，底物l 分子或酶分子，有时是两者的构象同时发生l 了一定的变化后才互补的。酶的活性部位l4）酶的活性部位是位于酶分子表面的一 个裂缝(crevice)内,是相当疏水的区域,在 裂缝内底物有效浓度可达到很高。l5）底物通过次级键较弱的力结合到酶上 。l6）活性部位具有柔性或可运动性。酶的活性部位酶活性部位的特点l10.1.2 研究酶活性部位的方法l10.1.2.1 酶分子侧链基团的化学修饰法l选择一种化合物，当其与被研究的酶作用时能 专门与活性部位氨基酸残基侧链基团共价结合 ，然后将这个带标记化合物的酶水解，肽键被 打开，但标记化合物共价键不被打开，因此可 以分离得到带有标签的肽段，即可分析出活性 部位的氨基酸残基。l巯基、羟基、咪唑基、氨基、羧基和胍基l化学修饰法有一定的缺陷：化学修饰有可能使活性部 位之外的某个氨基酸残基的侧链改变，而影响酶分子 的正常结构，因而导致酶活性的丧失。研究酶活性部位的方法lA.非特异性共价修饰l化学试剂已和活性部位基团结合的鉴别：l一.酶活力的丧失程度和修饰剂浓度成一定的 比例关系。l二. 底物或与活性部位结合的可逆抑制剂可保 护共价修饰剂的抑制作用，此法不但可以肯定 某种基团是必需基团，还可以确信此基团 位于酶的活性部位。研究酶活性部位的方法lB.特异性共价修饰l某一化学试剂专一地修饰酶活性部位的某一氨 基酸残基，使酶失活。l二异丙基氟磷酸(DFP)能专一性地与酶活性部 位的丝氨酸残基的羟基共价结合，使酶活力丧 失。l二异丙基磷酰化酶(DIP酶)研究酶活性部位的方法lDFP一般不与蛋白质反应，也不与胰凝乳蛋白 酶原和变性的胰凝乳蛋白酶反应，它也不和天 然胰凝乳蛋白酶活性部位Ser195以外的27个Ser 结合，可见活性部位Ser处于一个特殊的结构 中，对DFP敏感。l对含有DFP集团的片段进行分析，不仅知道该 酶活性部位附近的氨基酸顺序，也可得知DIP 标记在该酶分子的Ser195残基上。研究酶活性部位的方法lC. 亲和标记(affinity labeling)法 l合成与底物结构相似的共价修饰剂。l一.可以较专一地引入酶的活性部位，接近底 物结合位点。l二.具有活泼的化学基团可以与活性部位的某 一基团结合形成稳定的共价键。利用酶对底物 的特殊亲和力将酶加以修饰标记，故称亲和标 记。试剂称“活性部位指示试剂”。研究酶活性部位的方法l胰凝乳蛋白酶l对甲苯磺酰L苯丙氨酸乙酯(TPE)是底物l对甲苯磺酰L苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK)是 它的亲和试剂l可使组氨酸咪唑基烷化。l邹承鲁 研究酶必需基团的化学修饰和酶活性 丧失的定量关系。l图p387l中科院邹承鲁：l科学家有责任说明真相l科学道德败给了广告l中国科学院资深院士、第三世界科学院院士 ，我国著名生物化学家邹承鲁11月23日凌晨5 点在北京逝世，享年83岁。l“拿着试管和烧瓶的战士”l l邹承鲁1923年5月17日生于山东省 青岛市，祖籍江苏无锡。l1941年，他毕业于由天津迁到重 庆的南开中学高中部；同年，考 入设在昆明的由北京大学、清华 大学、南开大学三校联合组成的 西南联合大学，就读于化学系。1946年，在招考英庚款公费出国留学生的考试中， 他以第一名的优异成绩被录取。赴英后，师从英国 剑桥大学著名生物化学家D 基林(Keilin)教授。 1951年，邹承鲁获英国剑桥大学生物化学博士学位 。l1951年回国后与王应睐及汪静合 作纯化了琥珀酸脱氢酶，并发现 其辅基为与蛋白部分共价结合的 FAD。此外，他们对呼吸链及其 他酶系也进行了一系列的工作， 为我国酶学及呼吸链的研究奠定 了良好基础。l1958年，他参加发 起人工合成胰岛素工 作，并负责胰岛素A和 B链的拆合。这项工作 的完成确定了胰岛素 全合成的路线，为胰 岛素的人工合成做出 了重要贡献。l10.1.2.2 定点诱变法l利用定点突变技术（ site directed mutagenesis）,改变编 码蛋白质基因中的DNA序 列，研究酶活性部位的 氨基酸。定点诱变法l1987年，Craik将胰蛋白酶Asp102诱 变为Asn102。l酶活性降低5000倍。l羧肽酶A中Tyr248原认为催化所必须 ，Tyr248 的密码子（TAT）Phe (TTT)，kcat 不变，Km高6倍。l10.2 酶催化反应的独特性质lUnique characters of enzyme catalysisl1）酶反应可分成两类：一类反应仅仅涉 及到电子的转移，反应速率或转换数在 108S-1数量级；另一类反应涉及到电子和 质子两者或其他基团的转移，反应速率 在103S-1数量级。l2）酶的催化作用是由氨基酸侧链上的功 能基团和辅酶为媒介的。主要的是His、 Ser、Cys、Lys、Glu和Asp。l3）酶催化反应的最适pH范围通常是狭小的 。l4）与底物相比较，酶分子很大，而活性部 位通常只比底物大一点。酶催化反应的独特性质l10.3 影响酶催化效率的有关因素lFactors effecting enzyme catalysisl10.3.1酶和底物的邻近效应与定向效应邻近效应与定向效应l邻近效应有效浓度得以极大的升高，从而使反应速率 大大增加 如乙酸对硝基苯脂以咪唑催化水解的反应。l底物有效浓度增加24倍，反应速率加快24倍 。底物和酶的邻近效应与定向效应l咪唑催化对-硝基苯酚乙酸酯水解的反应：l将咪唑和对-硝基苯酚乙酸酯结合到一个分子上后，反应 速率增加24倍。底物和酶的邻近效应与定向效应l定向反应 正确取位产生的效应邻近效应与定向效应底物和酶的邻近效应与定向效应l例如，酯与羧基结合形成酐的反应相对速度和结构关系.l10.3.2底物的形变和诱导契合l敏感键l“电子张力”l底物底物分子发生形变影响酶催化效率的有关因素诱导契合学说 （1958， Daniel E. Koshland)：该学说认为酶表面并没 有一种与底物互补的固 定形状，而只是由于底 物的诱导才形成了互补 形状。底物的形变和诱导契合 In many enzymes, the active sites have shapes complementary to those of their substrates only after the substrates are bound (the induced fit). Weak interactions between substrates and enzymes may generate conformational changes on the enzyme for the induced fit effect. Induced fit may serve to bring specific functional groups on the enzyme into the proper orientation定向 and position (alignment调整为直线) to catalysis (need to overcome the entropy熵 increase). The induced conformation of enzyme active site is complementary not to the substrates per se本身 but to the transition states.10.3.3 酸碱催化 acid-base catalysis l酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子或从 反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一 类催化机制。l专一的酸碱催化或狭义的酸