DNA 重组技术的基本工具第第1 1节节问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有 一种可以合成毒蛋白的基 因。让细菌的毒蛋白基因 在棉花细胞中表达，可培 育出抵抗棉铃虫害的抗虫 棉。想一想需要做哪些关键工作 ？苏云金芽孢杆菌毒蛋白毒蛋白普通棉花 抗虫棉普通棉花 抗虫棉 基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内细胞内提取出来提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与棉花与棉花DNA“DNA“缝合缝合” ”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因进入棉花细胞进入棉花细胞 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀分子手术刀” 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因与棉花抗虫基因与棉花DNA“DNA“缝合缝合” ”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针分子缝合针” DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体思考： 1、自然界是否存在一种生物 的DNA进入另一生物的情况？一、一、“分子手术刀分子手术刀” 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2 2、人体是如何防御病毒的？、人体是如何防御病毒的？3、单细胞生物在进化过程中 并没有灭绝，它们是怎样防 御的？种类与命名：现在已经从约300种微生物中分离出了约 4000种限制性内切酶(限制酶)。E EcocoR RS Smama粘质沙雷氏杆菌 （Serratia marcesens）大肠杆菌大肠杆菌 （EscherichiaEscherichia coli coli R R）Go backGo back练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d ) 中先后分离到3种限制酶，则分 别命名为: Hind、Hind和HindT磷 酸 二 酯 键1234512345AGo backGo back 限制酶的识别序列：限制酶的识别序列：Go backGo backSmaSma平末端 平末端平末端 平末端EcoREcoR黏性末端 黏性末端Go backGo backEcoREcoR黏性末端 黏性末端Go backGo back重复演示重复演示限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6 6个碱基个碱基 还是还是4 4个碱基，都可以找到一条个碱基，都可以找到一条中心轴线中心轴线（ 如图），中轴线两侧的双链如图），中轴线两侧的双链DNADNA上的碱基是上的碱基是 反向、对称、重复反向、对称、重复排列的。排列的。 想一想限制酶所识别的序列有什么特点？想一想限制酶所识别的序列有什么特点？寻根问底寻根问底 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是 是什么吗？是什么吗？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNADNA的入侵的入侵， 但生物在长期的进化过程中形成了一套完善但生物在长期的进化过程中形成了一套完善 的防御机制，以防止外来病原物的侵害。的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限限 制酶制酶就是细菌的一种就是细菌的一种防御性工具防御性工具，当外源，当外源 DNADNA侵入时，会利用限制酶侵入时，会利用限制酶将外源将外源DNADNA切割切割 掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原 核生物中主要起到切割外源核生物中主要起到切割外源DNADNA、使之失效使之失效 ，从而达到，从而达到保护自身保护自身的目的。的目的。 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制 酶切几个切口？可产生几个黏性酶切几个切口？可产生几个黏性( (平平) )末端？末端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性( (平平) )末端。末端。 如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性相同的黏性( (平平) )末端末端，然后让两，然后让两 者的黏性者的黏性( (平平) )末端末端黏合黏合起来，就似乎可以合起来，就似乎可以合 成重组的成重组的DNADNA分子了。分子了。思考思考? ?Go backGo backGAATTCGAATTC CTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTC CTTAAGCTTAAGEcoREcoRGGAATTCAATTC CTTAACTTAAGGGGAATTCAATTC CTTAACTTAAGG不同来源的不同来源的DNADNA片段混合片段混合将不同种来源的将不同种来源的DNADNA片段连接起来片段连接起来生物生物A A基因片段基因片段生物生物B B基因片段基因片段GG AATTCAATTC CTTAACTTAA GGGG AATTCAATTC CTTAACTTAA GG酶切酶切二、“分子缝合针” DNA连接酶作用作用: :把切下来的把切下来的DNADNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNADNA， 即将即将脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来. .作用原理：作用原理：催化磷酸二酯键形成可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“ “缝合缝合” ”起来，起来，EcoliEcoli DNA DNA连接酶 或连接酶 或T T4 4DNADNA连接酶连接酶即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T T4 4DNA DNA连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“ “缝合缝合” ”起起 来，但效率较低来，但效率较低T T4 4DNADNA连接酶连接酶类型：类型：类型EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶来源来源功能功能大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体恢复恢复 磷酸磷酸 二酯键二酯键只能连接只能连接黏性末端黏性末端能连接能连接黏性末端黏性末端和和 平末端平末端( (效率较低效率较低) )相同点相同点差别差别（二）（二）“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接连接 酶酶DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点寻根问底寻根问底 DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗? ?为什么为什么? ?1)只能将单个核苷酸连 接到已有的核酸片段上 ，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之 间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板 ，将将单个核苷酸单个核苷酸通过磷通过磷 酸二酯键酸二酯键连接成一条互 补的DNA链2)将DNA双链上的两 个缺口同时连接起来 ，不需要模板Go on三、“分子运输车” 基因进入受体细胞的载 体 载体需要的条件：有1多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选 常用运载体：细菌的质粒噬菌体或某些动植物病毒假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能 转录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车载体，如果没有切割位点 将会怎样？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做 分子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？ 常用的载体：质粒常用的载体：质粒能复制并带着能复制并带着 插入的目的基插入的目的基 因一起复制因一起复制有切割位点有切割位点有标记基因的有标记基因的 存在，可用含存在，可用含 氨苄青霉素的氨苄青霉素的 培养基鉴别培养基鉴别Go onGo on思考与探究思考与探究 P7P71 1、为什么限制酶不剪切细菌本身的、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNADNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限通过长期的进化，细菌中含有某种限 制酶的细胞，其制酶的细胞，其DNADNA分子中或者分子中或者不具备不具备这这 种限制酶的种限制酶的识别切割序列识别切割序列，或者通过甲基，或者通过甲基 化酶化酶将甲基转移将甲基转移到所到所识别序列识别序列的碱基上，的碱基上， 使使限制酶不能将其切开限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌。这样，尽管细菌 中含有某种限制酶也不会使自身的中含有某种限制酶也不会使自身的DNADNA被被 切断，并且可以防止外源切断，并且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。 2 2、天然的、天然的DNADNA分子可以直接用做基因工分子可以直接用做基因工 程载体吗？为什么？程载体吗？为什么？提示：提示：基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的DNADNA分子很多都是质粒分子很多都是质粒 （plasmidplasmid），即独立于细菌拟核染色体），即独立于细菌拟核染色体DNADNA之外之外 的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNADNA分子分子 。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：思考与探究思考与探究 P7P71 1） 载体载体DNADNA必需有必需有一个或多个限制酶一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基的切割位点，以便目的基 因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点 所处的位置，还必须是所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外在质粒本身需要的基因片段之外，这样，这样 才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。2 2） 载体载体DNADNA必需具备必需具备自我复制的能力自我复制的能力，或整合到受体染色体，或整合到受体染色体 DNADNA上随染色体上随染色体DNADNA的的复制而同步复制复制而同步复制。3 3） 载体载体DNADNA必需必需带有标记基因带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选，以便重组后进行重组子的筛选 。4 4） 载体载体DNADNA必需必需是安全的是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入，不会对受体细胞有害，或不能进入 到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5 5） 载体载体DNADNA分子分子大小应适合大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太，以便提取和在体外进行操作，太 大就不便操作。大就不便操作。实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒DNADNA分子并不完全具备上述条件分子并不完全具备上述条件 ，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。3 3、DNADNA连接酶有连接单链连接酶有连接单链DNADNA的本领吗？的本领吗？迄今为止，所发现的迄今为止，所发现的DNADNA连接酶都连接酶都 不具有不具有连接单链连接单链DNADNA的能力，至于原因的能力，至于原因 ，现在还不清楚，也许将来会发现可以，现在还不清楚，也许将来会发现可以 连接单链连接单链DNADNA的酶。的酶。思考与探究思考与探究 P7P7已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素 的基因，的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标现探讨某细菌的质粒中有无