荧光分光光度法测定面粉中核黄素（VB2）一、实验目的二、实验原理三、FL-4500型气相色谱仪四、实验步骤五、数据处理六、思考题复旦化学系教学实验中心包慧敏*1、掌握面粉样品的消化方法，了解溶液的pH值等对核黄素荧光强度的影响。2、了解荧光分光光度计的主要结构及工作原理，掌握其正确使用方法。3、荧光分析法基本原理和学习测绘核黄素的激发光谱和荧光光谱，标准曲线法定量分析。一、实验目的Date二、实验原理1、荧光、荧光分子/荧光物质2、荧光分析法：特点 、定量方法3、核黄素VB2：结构、性质、 面粉中提取方法 4、荧光分光光度计：结构、原理、操作Date荧光产生的机制去活化过程问题1. 荧光、荧光分子Date强荧光物质结构特点： 、共轭 体系、 刚性平面结构、 取代 基如荧光素和酚酞结构十分相似， 荧光素在溶液中有很强的荧光， 而酚酞没有。如芴和联苯在相同的条件下，荧 光量子产率约为1和0.18Date影响荧光发射溶液环境因素 p.362 ： （a）溶剂效应：取决于荧光体和溶剂的化学结构、 极性、重原子效应 （b）温度：T f （c）pH 平衡解离关系 对f.max、f 均有影响溶液荧光的猝灭 p.364荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间相互作用而导致荧光强 度下降的现象称为荧光的猝灭（或熄灭） 引起荧光猝灭的物质称为荧光猝灭剂。Date问题2. 分子荧光分析法Date1. 原子光谱与分子光谱原子光谱：电子能级跃迁；分子光谱：电子能级、振动能级、转动能级跃迁2. 吸收光谱与发射光谱吸收光谱：从低能级向高能级跃迁，使光的强度减弱；发射光谱：从高能级跃迁回低能级，相应的能量以光的形 式辐射出来3. 关系原子光谱：原子吸收光谱、原子发射光谱；分子光谱：分子吸收光谱（可见、紫外、红外吸收光谱）光谱名称的问题：Date原子光谱 V.S. 分子光谱原子光谱/线光谱 ： 电子跃迁能级 （单重态、三重态）分子光谱/带光谱 ： 电子跃迁能级 分子振动能级 分子转动能级 Date激发光谱 荧光光谱em.max处IFex吸收光谱 V.S. 发射光谱Date图15-3三维荧光光谱的两种表示 （b）等高线光谱图 （a）等角三维投影图分子荧光光度法的一些基本概念l激发光谱、荧光光谱、三维荧光光谱用途？Date荧光强度 IF 与荧光物质的溶液浓度 c 成线性关系IF = 2.3F I0 b c b 试样的吸收光程 摩尔吸光系数 F 荧光发射的量子产率 IF 荧光强度 当 I0 及 b 一定稀溶液中c 试样浓度IF = k cI0 入射光强度荧光定量分析的基础Date标准曲线法（工作曲线法）1. 最大激发波长、最大吸收波长的选择；2. 系列标准溶液绘制工作曲线；3. 测定未知溶液，查得其浓度。标准曲线法求解K ：（1）图解法（2）解析法 Datel灵敏度高：测定下限在0.10.001 g/mL，比分光光度法高24个数量级。光强I与I0的信号差别 荧光发射的光强l选择性高：适当选择激发光波长和荧光测定波长 产生荧光的化合物有限，不及分光光度法广泛，干扰物质较少分子荧光分光光度法 v.s. 紫外-可见分光光度法Date三、F-4500型荧光分光光度计比色皿：？样品槽：DateF-4500型荧光分光光度计光路图Date1、开机Power-Xe lamp-Main启动软件 FL Solutions ProgramF-4500型荧光分光光度计的使用Date2、波长扫 描 wavelength? ScanStart Method Sample Pre-scan Measure 数据处理 ReportMethod:F-4500型荧光分光光度计的使用Date1、试样溶液制备2、实验条件的选择3、标准曲线的绘制及样品的测定四 、实 验 步 骤Date关于核黄素VB2、面粉中提取方法面粉主要成分 淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等。营养强化面粉国 家标准面粉中核黄素含量110-6510-4g/L，回收率为98% 105%. 方法检出限410-8g/L核黄素 又称维生素B2，维他命B2Riboflavine C17H20O6N4微溶于水；对空气、氧气稳定，对光 敏感，在430440nm蓝光照射下会在 525nm附近发绿色荧光；在pH67的 水溶液中荧光最强，在pH为11时荧光消失。Date面粉10g400mL烧杯加0.1mol/L盐酸100mL冷却后，用NaOH调至pH6.0-6.5，然后立即加稀盐酸至pH4.5将混合物定量转移至250mL容量瓶，用(5:95)醋酸溶液定容。离心取清液，避光，待测1、试样溶液制备剧烈搅拌，倒入150mL沸水，维持微沸30min并搅拌使均匀分散核黄素在碱性溶液中不稳定，要边加边摇防止局部碱性过强加1滴丁醇配平，离心取上清Date（1）激发光波长、荧光波长选择 吸取核黄素标准溶液1mL于25mL容量瓶，用(5:95)醋酸溶液定容。 暂设定荧光波长即发射光波长EX:525nm,在400-500nm波长范围对激发 波长进行扫描，记录激发光谱曲线；取最大激发波长EM,在400-500nm波长范围对荧光波长进行扫描，记录荧光光谱曲线。 确定最佳激发光波长、荧光波长（2）酸度选择 取三个25mL容量瓶，各加入核黄素标准溶液1mL，然后分别用1:1盐酸 ，(5:95)醋酸，5%NaOH溶液稀释到刻度。 分别测定溶液pH值，测定荧光强度，考察酸度对荧光强度的影响，从中确定最佳酸度。2、实验条件的选择3、标准曲线的绘制及样品的测定Date五、数据处理1、从荧光光谱图上读出最大激发（ex）和发射波长（ em）2、软件绘制标准工作曲线法3、计算面粉提取液中维生素B2的含量Date本实验注意事项1）溶液的配制：盐酸浓度，NaOH调节pH理论计算等2）标准溶液移取与稀释操作3）系列标液的测定顺序4）样品保存，防止光降解5）荧光仪的开关机顺序Date六、思考题1. 在荧光测量中，为什么激发光的入射与荧光的接 收不在一直线上，而呈一定角度？2. 试述荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计在 结构上的有哪些不同点？3. 定量测定维生素B2可用的方法有哪些？试比较各 种方法的优缺点。Date氧化型还原型问题3面粉的主要成分？ 淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等。营养强化面粉国家标准 面粉中核黄素含量110-6510-4g/L，回收率为98%105%. 方法检出限410-8g/L。核黄素结构性质？ 对空气、氧气稳定，对光敏感，在430440nm蓝光照射下会在525nm附 近发绿色荧光；在pH67的水溶液中荧光最强，在pH为11时荧光消失 。Date