专题专题3 3 植物组织培养技术植物组织培养技术一、基础知识一、基础知识课题课题1 1： 菊花的组织培养菊花的组织培养1 1、植物的组织培养、植物的组织培养（1 1）细胞的分化）细胞的分化概念：概念： 在个体发育中，相同细胞的后代在形在个体发育中，相同细胞的后代在形 态、结构、生理功能上发生稳定性差态、结构、生理功能上发生稳定性差 异的过程异的过程 过程过程 ：如：受精卵增殖、生长、分化形成组如：受精卵增殖、生长、分化形成组 织、器官、系统织、器官、系统特点：特点：（2 2）稳定性稳定性 ：（3 3）全能性：全能性：（1 1）持久性持久性 ：是一种持久性的变化，它发生在生物体的整是一种持久性的变化，它发生在生物体的整 个生命过程中个生命过程中, ,在胚胎期达到最大限度在胚胎期达到最大限度细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的已分化的细胞，仍具有发育的潜能已分化的细胞，仍具有发育的潜能原因：原因： 基因在特定的时间和空间条件下的选基因在特定的时间和空间条件下的选 择性表达的结果择性表达的结果结果：结果： 形成不同的细胞和组织形成不同的细胞和组织（2 2）细胞的）细胞的全能性全能性定义：定义： 生物体的细胞具有使后代细胞形成完整生物体的细胞具有使后代细胞形成完整 个体的潜能的特性个体的潜能的特性原理：原理： 生物体的每一个细胞都包含有该物种所生物体的每一个细胞都包含有该物种所 特有的全套遗传物质，都有发育成为完特有的全套遗传物质，都有发育成为完 整个体所必需的全部基因整个体所必需的全部基因高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能 性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性 ，这是因为细胞核内含有，这是因为细胞核内含有该物种遗传性所需要该物种遗传性所需要 的遗传物质的遗传物质已分化的植物细胞，仍具有已分化的植物细胞，仍具有全能性全能性实例实例受精卵受精卵 生殖细胞生殖细胞 体细胞体细胞全能性的比较全能性的比较: :（3 3）植物组织培养）植物组织培养 细胞离体细胞离体必要条件必要条件 ：一定的营养物质、激素和其他一定的营养物质、激素和其他 外界条件外界条件原理原理: :细胞的全能性细胞的全能性外植体：从活植物体上切下进行培养的那部外植体：从活植物体上切下进行培养的那部 分细胞、组织或器官分细胞、组织或器官相关概念相关概念: :脱分化：脱分化：再分化：再分化：愈伤组织愈伤组织: :细胞排列疏松而无规则细胞排列疏松而无规则, ,是高度液泡是高度液泡 化的、成无定形状态的薄壁细胞化的、成无定形状态的薄壁细胞科目三考试 http:/km3.jsyst.cn 科目3实际道路考 试技巧、视频教程科目四考试 http:/km4.jsyst.cn 科目四模拟考试题 C1 科目四仿真考试人参的愈伤组织人参的愈伤组织菠萝的愈伤组织菠萝的愈伤组织2 2、影响植物组织培养的因素、影响植物组织培养的因素（1 1）植物材料的选择）植物材料的选择烟草和胡萝卜的组织培养较为容易烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞枸杞愈伤组织的芽诱导比较难愈伤组织的芽诱导比较难同一植物材料的年龄、保存时间的长短会同一植物材料的年龄、保存时间的长短会 影响实验结果影响实验结果菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎 上部新萌生的侧枝上部新萌生的侧枝（2 2）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条 件的要求相对特殊，需配置不同的培养基件的要求相对特殊，需配置不同的培养基 MSMS培养基主要成分包括：培养基主要成分包括：A A、大量元素大量元素: : N N、P P、 S S 、 K K、CaCa、MgMg等等B B、微量元素微量元素: :B B、MnMn、CuCu、ZnZn、FeFe、MoMo、I I、CoCo等等C C、有机物、植物激素有机物、植物激素讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题 2 2中微生物培养基的配方相比，中微生物培养基的配方相比，MSMS培养基的配方培养基的配方 有哪些明显的不同？有哪些明显的不同？答：答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必 需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞 的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满 足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后 所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营 养为主。与微生物的培养不同，养为主。与微生物的培养不同，MSMS培养基则需培养基则需 提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长 必须的大量元素和微量元素两大类。必须的大量元素和微量元素两大类。常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和 赤霉素赤霉素生长素类：生长素类：2 2，4 4二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2 2，4 4DD）、）、 吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAAIAA）、）、萘乙酸（萘乙酸（NAANAA） 、吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBAIBA）细胞分裂素类：细胞分裂素类：激动素（激动素（KTKT）、）、6 6苄基嘌呤苄基嘌呤 （ 6 6BABA）、）、玉米素（玉米素（ZTZT）赤霉素类：赤霉素类：赤霉酸（赤霉酸（GA3GA3）（3 3）植物激素的影响）植物激素的影响生长素和细胞分裂素作用生长素和细胞分裂素作用 植物中植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、 脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在 的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势使用顺序使用顺序实验结果实验结果 先使用生长素，后使用先使用生长素，后使用 细胞分裂素细胞分裂素有利于细胞分裂，但不有利于细胞分裂，但不 利分化利分化 先使用细胞分裂素后使先使用细胞分裂素后使 用生长素用生长素细胞既分裂也分化细胞既分裂也分化同时使用同时使用分化频率高分化频率高生长素生长素细胞分裂素细胞分裂素 ： 有利于根的分化有利于根的分化生长素生长素细胞分裂素：细胞分裂素：生长素生长素细胞分裂细胞分裂 素素 生长素生长素再分化再分化植物细胞培养植物细胞培养不需要光不需要光需要光需要光1 1、培育无病毒植株、培育无病毒植株2 2、 培养紫草愈伤组织培养紫草愈伤组织, ,提取紫草素（提取紫草素（治疗烫伤治疗烫伤 和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）4 4、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法4 4、植物组织培养的应用：植物组织培养的应用： 3 3、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力 的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子 ，可以解决，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困有些作物品种繁殖能力差，结子困 难或发芽率低等问题难或发芽率低等问题人工种子人工种子二、实验操作二、实验操作 （一）制备（一）制备MSMS固体培养基固体培养基MSMS培养基包括培养基包括2020多种营养成分，实验室一般多种营养成分，实验室一般 使用使用4 4。C C保存配制好的培养基母液来制备保存配制好的培养基母液来制备1 1、配置各种母液、配置各种母液无机物中大量元素浓缩无机物中大量元素浓缩1010倍，微量元素浓倍，微量元素浓 缩缩100100倍，常温保存倍，常温保存激素类、维生素类以及用量较小的有机物一激素类、维生素类以及用量较小的有机物一 般可按般可按1 1mg/mlmg/ml的质量浓度单独配制成母液的质量浓度单独配制成母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液 的浓缩倍数，计算用量的浓缩倍数，计算用量2 2、配置培养基、配置培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装分装到锥形瓶中，每瓶分装5050mlml或或100100mlml 配制培养液配制培养液 调调PHPH培养基的分装培养基的分装 由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此 不必添加植物激素不必添加植物激素3 3、灭菌、灭菌 分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸 汽灭菌汽灭菌1 1、选材：、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外植体消毒（二）外植体消毒2 2、消毒、消毒流水冲洗流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷 轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗2020minmin左右左右 酒精处理酒精处理 用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体 积分数为积分数为7070的酒精中摇动的酒精中摇动2 23 3次，持续次，持续6 6 7 7s s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗立即将外植体取出，在无菌水中清洗 消毒液处理消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分， 放入质量分数为放入质量分数为0.10.1的氯化汞溶液中的氯化汞溶液中1 12 2minmin ，取出后在无菌水中至少清洗取出后在无菌水中至少清洗3 3次，漂净次，漂净消毒液消毒液（三）接种三）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种 室消毒是至关重要的。用室消毒是至关重要的。用7070的酒精喷雾使空的酒精喷雾使空 气消毒，气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外 线照射线照射2020分钟分钟1 1、接种室消毒、接种室消毒2 2、无、无菌菌操作要求操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后 ，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶 盖。盖。3 3、材料的切取和接种、材料的切取和接种4 4、接种注意事项、接种注意事项每接种一块外植体前，镊子需放入体积分每接种一块外植体前，镊子需放入体积分 数为数为7575的酒精溶液中消毒一次，然后在酒的酒精溶液中消毒一次，然后在酒 精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体 数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3 3 4 4块，菊的茎或叶块，菊的茎或叶6 68 8块，也不要太少，以充块，也不要太少，以充 分利用培养基中的营养成分和光照条件分利用培养基中的营养成分和光照条件插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖 基部插入培养基利于吸收水分和养分基部插入培养基利于吸收水分和养分思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实 验吗？验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。 设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养 基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，基的锥形瓶，与接种操作后的锥