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*1*2蛋白质的含量测定 凯氏定氮法:1883年丹麦化学家 Kjeldhl建立,经后人改良后形成的一 种定量测定蛋白质最为精确、敏感的 方法。 原理:蛋白质的含氮量为16,只要 测出样品中氮的含量,即可计算出蛋 白质的含量样品中蛋白质的含量N6.25*3凯氏定氮的基本流程: 1、消化:生物样品与浓硫酸共煮, 样品蛋白质被无机化,其中氮元素 转变为硫酸铵。PrH2SO4 CO2H2O(NH4)2SO4(NH4)2SO4+2NaOH NH4OH+H2SO4NH4OH+HCl NH4Cl+H2O*4*5*6*7凯氏法的评价: 优点:缺点:1、适用于一切形态的样品; 2、不用比色,对混浊不透明的样品也可 进行分析; 3、结果的精、准度较高。1、样品中含有非蛋白态氮时影响分析结 果; 2、组成蛋白质的氨基酸可影响分析结果 ; 3、操作复杂,对操作者的要求高。*8Lowry法 Lowry法原理:是在双缩脲法和Folin 酚法的基础上建立的一种新的蛋白 质定量方法。蛋白质在碱性条件下 与铜离子反应生成紫红色络合物。 然后再与Folin试剂反应生物深蓝色 。颜色与蛋白质含量成正比,符合 朗伯比尔定律。*9方法评价 优点 1、可对多个样品同时进行分析,操作简便; 2、结合Folin酚法,提高了分析的灵敏度; 3、结合双缩脲法,避免了Folin酚法的局限。 缺点 1、比色测定,要求显色后溶液透明,且样品必 需可溶; 2、酚方式剂在碱性溶液中稳定性差,显色后需 尽快比色; 3、干扰反应的因素较多。*100 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mg/mlA0.80.60.40.2*11*12紫外吸收法 原理:蛋白质在紫外区有两个吸收峰, 其一为280nm,由芳香氨基酸上共轭双 键引起,芳香氨基酸在各种蛋白质的的 含量差别不大,测蛋白质溶液在280nm 处的吸收值可计算出样品中蛋白质的含 量。蛋白质第二紫外吸收峰在240nm以 下,215nm最大,此峰是肽键引起。可 通过215nm与225nm的差值计算出蛋白 质的含量。*13考马斯亮蓝G-250染色法 原理:考马斯亮蓝在一定浓度的乙醇和酸 性溶液中呈现红色,与蛋白质结合后变为 蓝色,最大吸收峰从465nm移到596nm。 优点: (1)操作简便;(2)敏感度较高 (3)颜色稳定(4)对干扰剂不敏感。 缺点: (1)染料与蛋白质的实际状况复 杂,色素与样品中的蛋白质不一定以当量 相结合;(2)要求样品完全溶解;(3) 样品不能回收使用。*14蛋白质相对分子量的测定 SDSPAGE法测蛋白质的相对分子 量:带电颗粒在电场中的迁移主要受 三个因素的作用,即场强、颗粒本身 的电荷及分子形状。因此一般电泳无 法直接测定蛋白质的分子量。加入变 性剂SDS后,蛋白质变性肽链伸展且 蛋白质所带电荷被SDS的负电荷覆盖 ,在相同的电场下,蛋白质的迁移率 只与蛋白质的分子量相关。*15lgMr=lgK-bm=K1-bm*16SDS-PAGE法测定分子量的操作: 1、标准蛋白质样品的制备:按商品 说明书使用。 2、待测样品的制备:取待测蛋白质 样品0.5mg,加入0.01mol/L磷酸缓 冲液(pH7.0)1ml溶解。与标准蛋白质 一起加入等体积的样品缓冲液,混匀 ,沸水浴加热3分钟后上样。 3、电泳分离及染色:*174、计算相对迁移率:Rf=蛋白样品移动距离(cm) 指示染料移动距离(cm)*18*19*20凝胶过滤测蛋白质分子量:测定大分子 的分子量是凝胶过滤的应用之一。将已 知分子质量的标准物质,在同一凝胶柱 上以相同条件进行过滤层析,由于加入 凝胶柱的物质分子质量不同,洗脱体积 也不同。可根据洗脱体积求出柱的分配 常数Kav,而Kav与蛋白质分子质量之 间又存在线性关系,利用这一关系可绘 制出Kav与分子质量的标准曲线。*21*22VeK1K2logMr *23*24*25方法的局限性: 1、在pH68的范围内,直线关系比 较好,在极端pH时因蛋白质变性而引 起偏离; 2、分子量与分配系数Kav有关,当蛋 白质的轴比较大时,会引起测定偏离 ; 3、糖蛋白的含糖量大于5时,测得 的分子量比真实分子量大。*26*27沉降速度法S 沉降速度离心力dx/dt 2x1dt2dxxm=SRTD(1-)*28沉降平衡法m=2RTln(C1/C2)(1-)2(X22-X12)*29等电聚焦测定蛋白质的等电点 等电点分析:电泳结束后三氯乙酸固 定并除去凝胶中的载体两性电解质, 考马斯亮蓝R250染色,漂洗显带后 测定蛋白质等电点。 1、利用已知等电点标准蛋白质的等电 点为纵坐标,距正极的距离为横坐标 作图得标准曲线,在此标准曲线上根 据待测样品的位置求出其等电点;*302、利用微电极直接测定凝胶表面的 pH而得知样品的等电点; 3、将凝胶切成等距离(5nm)的小块, 浸于水中,用精密试纸测定pH。以凝 胶块距正极的距离为横坐标,pH为纵 坐标作用图得出胶的pH梯度曲线。根 据待测样品在凝胶中的位置而得出蛋 白质样品的等电点。*31其它蛋白质定性定量分析技术 蛋白质的电泳染色定量分析 特定蛋白质在总蛋白中所点比例的分析:最 早应用于血浆蛋白电泳分离后白蛋白和球蛋 白的比例测定。其方法有二,其一是将染色 后的蛋白区带剪下,用适当的溶剂提取后比 色测定;其二用反射扫描仪处理后,计算各 峰面积比而得出各成分的相对含量。 与已知含量的标准蛋白一起电泳染色扫描后 与标准蛋白比较,得出样品蛋白的含量。*32*33*34*35免疫印迹技术的基本操作(例PKC) 1、细胞裂解物的制备 2、细胞裂解液蛋白含量测定 3、细胞裂解物SDSPAGE电泳 4、蛋白质转膜 5、目的蛋白的检测*36*37
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