4.抗体生物制品抗体的结构、分类与功能多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体Emil von Behring, 1901, antitoxinsGeoreges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibodySusumu Tonegama,1987, structure of Ig geneGerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibodyPaul Ehrlich , 1908, production of antibodyNobel Prize winners抗体药物销售趋势图抗体药物销售趋势图1.抗体的结构、分类与功能抗体是一种蛋白质抗体由四条蛋白质长短链组成(两长两短)抗体分子上有两个抗原结合区(二者相同)抗体与抗原结合是专一性的(lock ; 分子小，穿透力强分子小，穿透力强; ; 不含不含FcFc，没有，没有FcFc带来的效应带来的效应; ; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒 排出排出; ; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免 疫毒素或酶标抗体等。疫毒素或酶标抗体等。3 3 小分子抗体小分子抗体FvFvScFvScFv单区抗体单区抗体最小识别单位最小识别单位FabFab由完整的由完整的轻链和轻链和FdFd组成，大小为完整分子组成，大小为完整分子 的的1/31/3。 把 把FabFab与细菌的前导肽相连，在前导肽的与细菌的前导肽相连，在前导肽的 作用下作用下FabFab进入质周腔，装配折叠后，它具有进入质周腔，装配折叠后，它具有 结合抗原的活性。结合抗原的活性。(1)Fab(1)Fab免疫球蛋白 基因载体的构建H链表达载体L链表达载体共转染细胞Pr VH CH1 Pr VL CLFab 抗体分子的制备抗体分泌细胞VHVLCL-S-S-CH1FvFv、ScFvScFv的大小约为全分子的的大小约为全分子的1/61/6。(2)Fv (2)Fv 或或 ScFvScFvFvFvScFvScFv连接肽连接肽FvFv由由VHVH与与VLVL构成，由于其结合是非共价构成，由于其结合是非共价结合，故结合，故FvFv不稳定。不稳定。在 在VHVH与与VLVL之间加上一段连接肽，把之间加上一段连接肽，把VHVH与与VLVL连成一条单链，得到连成一条单链，得到ScFvScFv，即单链抗体，即单链抗体。连接肽连接肽的长度在的长度在10-1510-15个氨基酸左右，不个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)(GGGGS)3 3。单链抗体单链抗体的构建在已知亲本的构建在已知亲本DNADNA序列时可用序列时可用完全完全人工合成法人工合成法; ;在具备亲本单抗可变区的 在具备亲本单抗可变区的cDNAcDNA克隆时，可用克隆时，可用定点突变法定点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中体中; ;如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用 如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCRPCR方法方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。上。单链抗体单链抗体最常用的最常用的表达体系是表达体系是大肠杆菌，大肠杆菌，有有 2 2种方式种方式: :一是表达为 一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白包涵或非包涵体的不溶蛋白。产。产 量高，可达细菌蛋白总量的量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%5%-20%，但需进行变，但需进行变 性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活 性性; ;二是 二是分泌型表达分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单，将细菌的信号肽序列与单 链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到 质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分 子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每 升细菌的产量仅在数毫克左右。升细菌的产量仅在数毫克左右。分别构建载体L链表达载体H链表达载体共转染细胞Pr VH Pr VL Fv 二硫键稳定的Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)小分子抗体的制备抗体分泌细胞VHVL-S-S-disulfide-stabilized Fv, ds-FvVH VL接头DNA (Gly4Ser)3 VH引物PCR VH 接头DNA酶切、克隆 ScFv (single chain Fv,scFv )的构建 变性、复性VL引物VL即为即为VHVH，约为完整分子的，约为完整分子的1/121/12。它只由一个。它只由一个 结构域构成，故称结构域构成，故称单域抗体。单域抗体。单域抗体尽管亲单域抗体尽管亲 和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。 (3)单域抗体VHVH约为完整分子的约为完整分子的1/80-1/701/80-1/70大小，一般大小，一般 由一个由一个CDRCDR构成，它也保持着抗体的特异性构成，它也保持着抗体的特异性 。(4)最小识别单位CDRCDR4 4 双特异抗体和多价抗体双特异抗体和多价抗体双链抗体双链抗体 （DiabodyDiabody）一词最早由）一词最早由HollingerHollinger等于等于19931993年创造。乃是一种小分年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。子的双价双特异性抗体片段。 双特异性抗体双特异性抗体(bispecific (bispecific antibody,BSAb)antibody,BSAb)是指能同时识别是指能同时识别2 2种抗原的抗种抗原的抗体。体。1 1种为对应肿瘤相关抗原。另种为对应肿瘤相关抗原。另1 1种为对应种为对应效应成分。效应成分。即能即能结合靶肿瘤细胞结合靶肿瘤细胞又能又能结合高细胞毒结合高细胞毒性的效应细胞性的效应细胞, ,将效应细胞富集在肿瘤周围将效应细胞富集在肿瘤周围, ,而且可以模拟天然配体的作用而且可以模拟天然配体的作用, ,与细胞表面引与细胞表面引发分子结合发分子结合, ,激活效应细胞激活效应细胞, ,实现对肿瘤细胞实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。的杀伤和裂解。 HollingerHollinger等巧妙地将抗原抗体的轻等巧妙地将抗原抗体的轻链可变区基因链可变区基因(VLA)(VLA)与抗抗原抗体的重链与抗抗原抗体的重链可变区可变区(VHB)(VHB)通过短肽连接子连接通过短肽连接子连接; ;同样地同样地, ,将将VHAVHA与与VLBVLB连接连接, ,将两组将两组嵌合基因嵌合基因置于双顺置于双顺反子的表达质粒中反子的表达质粒中, ,构建成双链抗体的表达构建成双链抗体的表达质粒质粒, ,目前报道的表达质粒均为双顺反子。目前报道的表达质粒均为双顺反子。表达后表达后,VLA VHB,VLA VHB与与VHA VLBVHA VLB交叉连结交叉连结, ,形成形成双特异性抗体。双特异性抗体。所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比治疗相比, ,除了能除了能特异性识别肿瘤细胞特异性识别肿瘤细胞外外, ,还能还能将循环血液中的免疫效应细胞再导将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处向至肿瘤细胞处, ,从而使效应细胞的抗肿从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强瘤活性增强, ,发挥免疫导向作用发挥免疫导向作用, ,这是肿这是肿瘤治疗的新突破。瘤治疗的新突破。抗体库技术是用基因工程方法把人或其他抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的动物的全部抗体的轻、重链可变区基因全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出克隆出 来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特 异基因和抗体。异基因和抗体。 主要有以下两种技术：主要有以下两种技术： 免疫球蛋白免疫球蛋白FabFab片段在大肠杆菌中的成功表达片段在大肠杆菌中的成功表达 噬菌体表面展示文库技术噬菌体表面展示文库技术5 5 抗体库技术抗体库技术初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总 RNARNA，反转录成，反转录成cDNAcDNA或直接用总或直接用总DNADNA为模板，用为模板，用 PCRPCR技术建立轻、重链文库，在大肠杆菌中表技术建立轻、重链文库，在大肠杆菌中表 达后筛选。达后筛选。它是在它是在PCRPCR技术和技术和Phage DisplayPhage Display的基础上实的基础上实现的。其过程是把用现的。其过程是把用PCRPCR法得到的抗体基因插法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的入丝状噬菌体的DNADNA，与噬菌体外壳蛋白的基，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与成丝状噬菌体，抗体分子通过与P P 或或PP相相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术噬菌体表面展示系统噬菌体表面展示系统( (phage surface display systemphage surface display system ) )融合蛋白PIII基因型表达型LeadHvLinkLvEPIII噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合 蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将 其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质 的功能与其基因密码有机的连结在一起。 非展示系统 展示系统噬菌体抗体库的构建VHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab)2FabFcMembrane ExtensionVHVLCLCH1CH2CH3VHVLCLCH1CH2CH3FvFv VHVL scFv VHVLSingle Chain Fragment variable单克隆抗体 噬菌体抗体杂交瘤技术 展示技术宿主细胞: 杂交瘤 细菌 筛选范围 : 103 107109 时间: 几个月 几周 操作: 繁杂 相对简单 免疫: 必须 可避免 人源抗体: + 费用: 高 低 生产量: 有限 无限 基因获取: 再克隆 直接应用前景: 有限 不可估 噬菌体抗体库的选择过程 BBBBBBvvImmunotubecoated withantigencoated withsteptavidin and biotinylated antigenBbiotinantigenSolution phase selection with biotinylated antigen Bind to Streptavidincoated