第十章 DNA的复制和修复第一节 半保留复制 第二节 参与DNA复制的酶与蛋白 质 第三节 复制过程 第四节 DNA损伤及修复一、概念以亲代DNA双链 为模板以碱基互补 方式合成子代DNA， 这样新形成的子代 DNA中，一条链来自 亲代DNA，而另一条 链则是新合成的， 这种复制方式叫半 保留复制。几个相关概念：1. 复制起始点 (origin, ori)原核生物只有一个复制起始点；真核生物染色体DNA有多个复制起始点，同时形成多个复制单位， 两个起始点之间的DNA片段称为复制子(replicon)。2. 复制叉 (replication fork)复制时双链打开，分开成两 股，新链沿 着张开的模板生成，复制中形成的 这种Y 字形的结构称为复制叉。二、实验依据三、DNA复制的起点和方向环状 DNA复制时 所形成的Q结构起始点复制叉的推进复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图 (Caims实验)ABC环状DNA的复制 ABC四、复制特点半不连续复制半保留复制DNA的半不连续复制 复制过程复制叉的 移动方向解旋酶DNA聚合 酶III解链酶RNA引物引发体DNA聚 合酶ISSB335前导链随后链35复制的起始DNA链的延长DNA链终止 5RNA引物33复制特点第二节 参与DNA复制的酶与蛋白 质复制相关蛋白的基因：dna A、dna B、dna C dna X相应的表达产物蛋白质：Dna A、Dna B、Dna C Dna XDna A：辨认复制起始位点Dna B：解螺旋酶Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上结 合并打开双链。一、DNA聚合酶 （一）催化的反应特点以四种dNTP为原料需要模板需要引物 催化反应方向为5-3产物性质与模板链相同（二）大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA 聚合酶分子量每个细胞的分子统计数5-3 聚合酶作用3-5 核酸外切酶作用5-3 核酸外切酶作用转化率DNA 聚合酶109，000400+1120，000100+-0 .05400，00010-20+-50比较项目DNA 聚合酶切除引物 修复修复复制功能1999年发现聚合酶 和，它们涉及DNA的错误倾向 修复（errooune repair）DNA聚合酶 I（1）5 3 聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）； （2）3 5外切酶活性（在正常聚合条件下，此活性 不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对 功能。）；（3）还具有5 3外切酶活性（双链有效）；5 3 聚合酶功能(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 聚合反应机理：DNA聚合酶的3- 5外切酶水解位点353- 5核酸外切 酶水解位点DNA聚合酶3- 5外切酶活力切除引物、 切除突变的片段DNA聚合酶5- 3外切酶活力5- 3核酸外切 酶水解位点单链缺口5切除错配的核苷酸DNA-pol I:曾被称为复制酶(replicase)含量最多可被水解成两个片段 小片段(N端)：具有53外切酶活性 ； 大片段(C端)：具有聚合活性和35外切酶活性，也称为Klenow片段， 是常用的工具酶。DNA-pol III: 由10种亚基组成的不对称聚合体 催化效率最高大肠杆菌DNA聚合酶 全酶的结构和功能延长因子DNA聚合酶 两个 亚基夹住DNADNA聚合酶异二聚体核心酶校对引物的结 合和识别促使核心酶二聚化亚 基相对分 子量亚基 数目基因亚基功能 132000 27000 10000 71000 52000 35000 33000 15000 12000 370002 2 2 2 2 1 1 1 1 4dnaE dnaQ holE dnaX dadX holA holB holC holD dnaN聚合作用 3 5外切酶的校对功能组建核心酶 使核心酶二聚化 依赖DNA的ATP酶，形成复合物 与亚基结合，形成复合物 形成复合物 形成复合物 形成复合物 两个亚基形成滑动夹子，以提 高酶的持续合成能力DNA聚合酶全酶的亚基组成Arthur Kornberg 1918 Stanford University Stanford, CA, USA The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959“for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid“二、解旋酶（解超螺旋，也叫拓扑 异构酶、DnaB蛋白）拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作 用。拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连 接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量 。主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶：使DNA两条链发生断裂和再连接 。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复 制有关。DNA的超螺旋结构（原核）二级结构为闭环双螺旋；三级结构为超螺旋连环数（linking number , L） DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠 绕的次数扭转数（twisting number , T） DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示超螺旋数（缠绕数 , writhing number , W ）连环数（L）缠绕数（T）扭曲数W 松驰环25250 解链环23230超螺旋2325-2L=T+W三、解链酶（ DnaA蛋白）四、SSB五、引物酶六、DNA连接酶解螺旋/链 酶 (helicase) （ DnaA蛋白） : 模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用。解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质，当时称为rep蛋白。作用是利用ATP供能，解开DNA双链。四、SSBSSB曾被称为螺旋反稳定蛋白（ HDP）。SSB与解开的DNA单链紧密结合 ，防止重新形成双链，并免受核酸酶降 解。在复制中维持模板处于单链状态 。引物酶 (primase): 依赖DNA的RNA聚合酶。 催化RNA引物的合成。 在大肠杆菌，引物酶是dna G基因的产物 。 RNA引物：在DNA模板的复制起始部位由引物酶 催化NTP的聚合，形成短片段的RNA，为 DNA聚合提供3-OH末端。连 接 酶 连 接 切 口Mg2+连接酶ATP或NADAMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCT GAPACPPPP OHTGGATCGPTTPPPAACCT GAPACPPPTGGP缺口33555533模板链模板链大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬 菌体中，则要求ATP提供能量。 DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。第三节 复制过程一、复制起始二、链的延长（冈崎片段的合成）三、复制的终止一、复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、Dna A蛋白识别并在ATP存在 下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下 , Dan A蛋白变性13个bp的重复 序列,形成开链复合物。4 、Dna B借助于水解ATP产生的 能量在Dna C的帮助下沿5 3 方向移动，解开DNA双链 ，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（Dna G蛋白）开 始合成RNA引物。起始复合物前引 发复 合物开链复合物引发体 (primosome): 是由Dna B、Dna A、Dna C以及其他复制因子一起形成复合体，再结合引物酶形成较大的聚合体，结合到模板DNA上。二、链的延 长（冈崎片 段的合成） 真核生物的 冈崎片段为： 100-200bp 原核生物的 冈崎片段为： 1000-2000bp冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切 口的连接:引导链与随从链分别由哪些酶或蛋白参 与？三、复制的终止oric复制叉2复制叉1终止复制叉2终止复制叉1复制叉1复制叉2完成复制DNA拓扑异构酶连锁染色体DNA忠实性的保障1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱 基配对保证碱基配错几率约为1/1041/105。2、DNA聚合酶的35外切酶活性的校对功能 ，使碱基的错配几率又降低1001000倍。3、复制中的即时校读功能。真核细胞内有五种DNA聚合酶 DNA聚合 酶DNA聚合 酶 DNA聚 合酶 DNA聚合 酶DNA聚合 酶 定位 亚基数目 外切酶活性引物合成 酶活性 持续合成能力抑制剂功能细胞核 4 中等蚜肠肠霉素引物合成细胞核 1 低双脱氧 TTP 修复线粒体 2 3 5 外切酶 高双脱氧 TTP 线线粒体 DNA合成细胞核 2 3 5 外切酶 有PCNA 时时高蚜肠肠霉素核DNA合成细胞核 1 5 3 外切酶 高蚜肠肠霉素修复真核和原核DNA细胞复制比较真核细胞DNA复制的特点 多个起点复制起点起点起点起点起点起点端粒酶（telomerase）初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。53AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶特点：1. 由RNA和蛋白质构成的复合物2. 为特殊的逆转录酶，能以自身的 RNA为模板逆转录合成端粒DNA功能：合成端粒DNA，维持端粒的长度爬行模型：端粒合成的一种模型35TTTTGGGGTTTTG53AAAACCCCAAAACCCCCCAAA35TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG53AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT35AA TTTTG53AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG 整合和 杂交移位和 再杂交端粒合成的完成TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT53nAA3TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT53T TCCCCT nAA3TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT53T TAAAACCCC AAAACCCC AAAACCCCT n进一步加工继续 延伸第四节 DNA损伤及修复四、诱导修复（SOS修复）一、光修复二、切除修复三、重组修复 DNA紫外线损伤的光裂合酶修复1、形成嘧啶二聚体2、光复合酶结合于 损伤部位3、酶被可见光激活4、修复后酶被释放切除修复碱基丢失碱基缺陷或错配结构缺陷切开 核酸内切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA连接酶核酸内切酶核酸外切酶切开切除修复连接糖苷酶DNA的重组修复胸腺嘧啶 二聚体复制核酸酶及 重组蛋白修复复制DNA聚合酶 DNA连接酶重组重组修复SOS修复：这是一种在DNA分子受到较大范 围损伤并且使复制受到抑制时出现的 修复机制，以SOS借喻细胞处于危急 状态。DNA分子受到长片段高密度损伤 ，使DNA复制过程在损伤部位受到抑 制。损伤诱导一种特异性较低的新的 DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。由这些特异性较低的酶继续催化损 伤部位DNA的复制，复制完成后，保 留许多错误的碱基，从而造成突变。