1/102bHLH基因的电子克隆与结构分析一、研究背景二、基础知识三、技术路线四、研究方法2/102一、研究背景1、bHLH转录因子家族2、内含子演化学说3/1021、bHLH转录因子家族转录因子的bHLH家族在调控生物的发育过程（如神经细 胞、肌细胞和血细胞生成，性别决定，肠的发育）中起重 要作用。bHLH结构由约60个氨基酸长，由一个碱性区域（b）、 两个螺旋和一个环（HLH） 组成。HLH结构域促使相同 分子之间形成同型二聚体或 不同家族成员之间异型二聚 体，被二聚化作用组合在一 起的碱性区域能结合到特殊 的由6个核苷酸组成的DNA 序列上。+4/10245个bHLH转录因子家族-1/25/10245个bHLH转录因子家族-2/26/1022、内含子演化学说来自Emc基因结构的证据似乎支持内含子早现说。7/102人类Emc基因结构Hs ID1 mRNA 993 nt (NM_002165)100567ORF (155 aa)389184389708389948390405Intron (239bp)ID1 motif 319417-AA-A15255269839938/102大鼠Emc基因结构Rn Emc-1 mRNA 931 nt147147291567513ORF (148 aa)NW_047658.2 332635073326463733263507332639773326419933264637Intron (221bp)Emc-1 motif 265363-AA-A9319/102小鼠Emc基因结构Mm ID1 mRNA 930 nt149149293087533ORF (148 aa)NT_039207.6 935062169350737193506216935067069350693393507371Intron (226bp)ID1 motif 28538310/102红粉甲虫Emc基因结构-AA-ATcEmc mRNA 1059 nt14034041029105941448ORF (135 aa)Emc motif 149247NW_001093514 226250222512 Minus strand226250225848223137222512 Intron (2710bp)11/102家蚕Emc基因结构Ctg007027 14309 bp24632010BmbHLH44 (Emc) mRNA 1600 nt145461584557285Intron (3694bp)1582-AA-A160068496ORF (142 aa)TACTCGTGCGATTACGgtgagtacagGCACCTCTAAAAATactttGTGCGATTAACGGCACCTCTAAAAATaaaa+1ATGAAAGCG Emc motif 17927712/102果蝇Emc基因结构-AA-ADmEmc mRNA 2066 nt182682720482066263862ORF (199 aa)Emc motif 392490NT_037436 749402753493749402750227752272753493 Intron (2044bp)13/102埃及伊蚊Emc基因结构AaEmc mRNA 1189 nt18058061189341826ORF (161 aa)Emc motif 452550AAGE02004109 3329929732 Minus strand33299324953011529732 Intron (2379bp)14/102非洲疟蚊Emc基因结构AgEmc mRNA 1012 nt17267271012389667ORF (92 aa)Emc motif 497604 (36 aa)NW_045819 91518579150762 Minus strand9151857915113291510449150762Intron (87bp)15/102蜜蜂Emc基因结构-AA-AAmEmc mRNA 655 nt101309639ORF (165 aa)NW_001253369.1 674068672564 Minus strand674068673968673418672564Intron (549bp)673211672893Intron (317bp)1161655Emc motif 230328102 310655-AA-A ?16/102鸡Emc基因结构-AA-AGgEmc mRNA 1239 nt NM_205002199423 42412001239ORF (134 aa)NW_001471673.1 569940571687569940570164570262571687Intron (98bp)488570326489570978Intron (651bp)?176480Emc motif 20530317/102蟾蜍Emc基因结构-AA-AXtEmc mRNA NM_203554 1251 nt4435011224ORF (165 aa)AC151469.2 2707831244270782752028450312442850730522199497Emc motif 2283264445021251Intron (929bp)Intron (2014bp)18/102斑马鱼Emc基因结构-AA-ADrEmc ID1 mRNA 1010 nt14564579941010107493ORF (128 aa)Emc motif 269367NW_001510626.1 25047062503606 Minus strand2504706250425225041452503606Intron (106bp)19/102海胆Emc基因结构-AA-ASpEmc mRNA 1623 nt110851086125416235281193ORF (221 aa)Emc motif 672770NW_001465655.1 103958919551039581028669513894970Intron (7727bp)Intron (2653bp)16161255923169195520/102线虫Emc基因结构CeEmc mRNA 427nt (?)ORF (107 aa)NC_003284.6 42494264250738U51999.115960 16633317No Emc motif4249426Intron (60bp) 424948442495454249651Intron (779bp) 42504311672554250519Intron (47bp) 427 25642505674250738Ledent文章中，线虫没有Emc基因，此处mRNA转译结果，与Emc motif是 有些差别，但也许是最早的Emc？ CeEmc motif (possible) KIDTLNLAIAYINMLDDVLRTPEDSGQYIQKCV21/102海鞘Emc基因结构-AA-ACiEmc mRNA 846 nt183484650343ORF (97 aa)Emc motif 176274AABS01000107.1 3154130708 Minus strand315413070822/102二、基础知识1、基因的结构2、什么是EST？23/1021、基因的结构DNATranscriptionPre-mRNAExon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3SplicingMature mRNAORF-AAAAAAATranslation-AAAAAAA5-UTR3-UTRProtein24/1022、什么是EST？“EST是mRNA的碎片”RT-PCR（不同的实验室 可能得到不同的片段）AAAAAAAmRNA (可能很长)EST1 EST2 EST3EST4EST525/102三、技术路线有对应蛋白质找出蛋白质序列bHLH基序无对应蛋白质用蛋白质序列对 RefRNA做Tblastn用mRNA 序列对 genome 做blastn对genome序列 做内含子分析画出基因结构图用bHLH基序对 ESTs做Tblastn用SeqMan对相似 度在90%以上的 EST进行装配用装配出的序列对 ESTs做 blastn用SeqMan对相似 度在90%以上的 EST进行装配是用装配出 的序列对 genome 做 blastn否分析mRNA 的ORF否分析装 配出的 序列的 ORFBlastP将ORF翻译 出蛋白质序列装配出的 序列是否比上 次的长？26/102四、研究方法1、Blast搜索与序列提取2、内含子剪接位点分析3、Tblastn与序列装配4、基因结构图绘制27/1021、Blast搜索与序列提取1）Blastp2）提取mRNA序列3）Blastn4）提取基因组序列28/1021）BlastpClick here.29/102Blastp30/102输入bHLH基序与物种名称31/102Blastp点击打开参 数设定界面32/102更改搜索参数之后点击 BLAST 开始搜索将E值设为0.0001。33/102点击Identities=100%的序列号将E值设为0.0001。34/102记录序列号、氨基酸数目信息35/102将蛋白质序列复制到EditSeq中选中并复制36/102注意：要选择New Protein选择New Protein弹出的对话 框点击OK37/102全选、转成大写字母后复制到WORD文件中38/102蛋白质序列粘贴蛋白质序列粘贴处39/1022）提取mRNA序列点击此处40/102记录序列号、碱基数目信息41/102将mRNA序列复制到EditSeq中选中并复制42/102注意：要选择New DNA选择New DNA弹出的对话 框点击OK43/102找出mRNA序列的ORF先把光标放到第一各碱基 处，再电击Find ORF。44/102把ORF碱基转成大写字母45/102全选并复制到WORD文件中46/102mRNA序列粘贴mRNA序列粘贴处47/1023）BlastnClick here.48/102输入mRNA序列与物种名称、选择数据库1）mRNA序列2）物种名称3）数据库选择 要选择基 因组序列4）点击打开参 数设定界面49/102更改搜索参数之后点击 BLAST 开始搜索将E值设为0.0001。50/102将Blastn结果复制到WORD文件中Blastn结果粘贴处51/102找出基因组序列的始末点Query 1 ATCTTGGATTCCGCGGTAGCGGAGGCGGCGGTCAGGCGCCGCTTCTGGGGAGTGGCCTTT 60| Sbjct 149115810 ATCTTGGATTCCGCGGTAGCGGAGGCGGCGGTCAGGCGCCGCTTCTGGGGAGTGGCCTTT 149115751Query 3538 ACTG 3541| Sbjct 149048813 ACTG 149048810起始点终止点注意：数据来源于人类ARNT mRNA的Blastn结果。52/1024）提取基因组序列输入序列号，例： NC_000001.9选择CoreNucleotide53/102输入序列始末点不选起始点终止点起始点数字比终止点 数字大，就应选择此 处，否则不选。最后点击 Refresh54/102将基因组序列复制到EditSeq中选中并复制55/102注意：要选择Ne