1 DNA的重组DNA分子内 或分子间发生遗传信息的重新组合，称 为遗传重组 (genetic recombination),或者基因重排 (gene rearrangement) 。重组产物为重组体DNA (recombinant DNA) 。1.1.1 重组与变异变异是生物进化的重要因素之一，生物对环境的适 应机制，自然选择的重要基础。 可遗传的变异： 突变 （点突变，染色体变异）频率低，突变修复遗传重组交换 染色体的自由组合染色单体间的交换分子克隆和转基因技术(in vitro)普遍发生 自然界DNA分子均是重组体1.1 概述第六章 DNA的重组与转座1 DNA的重组1.1.2 遗传重组的类型同源重组（homologous recombination）、位点专一 性重组（site-specific recombination）和转座重组（ transposition recombination）和异常重组（ illegitimate recombination）根据的DNA序列和所需蛋白质因子的要求进行分类：大肠杆菌中四种遗传重组的一般特征类型是否需要 序列同源性是否需要 RecA蛋白质是否需要序 列特异性酶 同源重组位点专一性重组 转座重组 异常重组是否是否是 否 否 否否是 是 ？1.1 概述第六章 DNA的重组与转座1 DNA的重组1.1.3 遗传重组与重组DNA技术1.1 概述遗传重组：生物体内的基因交流。 重组DNA技术：体外人为地将不同源的DNA组合在一起。1.1.4 遗传重组的生物学意义它能迅速增加群体的遗传多样性(diversity)； 使有利突变与不利突变分开(separation)； 通过优化组合(optimization)积累有意义的遗传信息。第六章 DNA的重组与转座1 DNA的重组1.2 同源重组同源重组又称一般性重组。同源重组发生在DNA的同 源序列之间，真核生物非姊妹染色单体的交换，姊妹染 色单体的交换，细菌及某些低等真核生物的转化，细菌 的转导、接合等都属于这类型。 涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大 涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程异源双链区的生成 存在重组热点 需要重组酶 单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号特征第六章 DNA的重组与转座1.2.1 同源重组的分子机制 断裂重接模型（Breakagerejoining）a b A Ba B A b1930 Darlington)1 DNA的重组1.2 同源重组模板选择复制模型（copy-choice ）(1931 Belling)第六章 DNA的重组与转座1.2.1 同源重组的分子机制 Holliday模型 1964年美国学者Robin Holliday提 出了著名的Holiday模型。 Holliday结构 同源重组中连接两个DNA双链 的交换中间物,含有4股DNA链，在 连接处为了转换配对所形成交叉链 的连接点。 Holliday结构形成的分子机制（断裂复合 起始机制）有双链侵入模型、单链侵入模型、双链断裂修复模型第六章 DNA的重组与转座55（1）（2）双链侵入模型3 55 3 Meselson-Radding模型 单链入侵模型（链转移模型）置换侵入同化 异构化 分支迁移切割实验表明，两DNA分子必需具有75 bp以上的同源区才 能发生同源重组，同源区小于此数值将显著降低重组率。双链断裂重组模型 分枝迁移（branch migaration）双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散1.2.1 同源重组的分子机制 Holliday模型 第六章 DNA的重组与转座Holliday的异构化产生重组体的拆分Holliday结构一经生成即可 不断地处于异构化异源双链 heteroduplex DNA重组结果取决于拆分时 配对链上的切口位置第六章 DNA的重组与转座1.2.1 同源重组的分子机制 Holliday模型 （1）（2） Holliday结构的拆分产生含异源双链 的亲本DNA分子产生重组体第六章 DNA的重组与转座第六章 DNA的重组与转座Holliday 中间体第六章 DNA的重组与转座1 DNA的重组1.2.2 细菌的基因转移与重组 1.2 同源重组细菌基因转移主要有四种机制：接合(conjugation)、 转化(transformation)、转导(transduction)和细胞融合 (cell fusion)。进入受体细胞(recipient cell)的外源基因 通常有四种结果：降解、暂时保留、与内源基因置换 和发生整合。共同特点是： 单方向转移； 产生部分二倍体（partial diploid）； 基因只有整合到环状染色体上才能稳定地遗传。第六章 DNA的重组与转座1.2.2 细菌的基因转移与重组 接合作用细菌的细胞相互接触时遗传信息可以由一个 细胞转移到另一个细胞。性因子或F因子：编码与接合功能有关的蛋白质，能够促 使染色体基因转移的质粒称为致育因子、性因子或F因子重 组 区复 制 区转 移 区IS3IS2IS3OPOriTOriV第六章 DNA的重组与转座1.2.2 细菌的基因转移与重组 接合作用第六章 DNA的重组与转座第六章 DNA的重组与转座Hfr菌株F因子性导第六章 DNA的重组与转座大肠杆菌基因图第六章 DNA的重组与转座遗传转化(genetic transformation)是指细菌品系由于吸收了外源DNA(转化因子)而发生遗传性状的改变现象。具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞(competent cell)。很多细菌在自然条件下就有吸收外源DNA的能力(如固氮菌、链球菌、芽孢杆菌、奈氏球菌及嗜血杆菌等)。1.2.2 细菌的基因转移与重组 遗传转化第六章 DNA的重组与转座1.2.2 细菌的基因转移与重组 转导转导(transduction)是通过噬菌体将细菌基因 从供体转移到受体细胞的过程。普遍性转导(generalized transduction)：是指宿主基 因组任意位置的DNA成为成 熟噬菌体颗粒DNA的一部分 而被带入受体菌局限性转导(specialized transduction)：某些温和噬 菌体在装配病毒颗粒时将宿 主染色体整合部位的DNA切 割下来取代病毒DNA。第六章 DNA的重组与转座在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜 融合导致的基因转移和重组。在实验室中， 用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖，使之成 为原生质体，可人工促进原生质体的融合， 由此使两菌株的DNA发生广泛的重组。 细胞融合1.2.2 细菌的基因转移与重组 第六章 DNA的重组与转座1 DNA的重组1.2.3 与重组相关的酶 1.2 同源重组 RecA蛋白D DNA重组活性C 与ssDNA结合活性A 少数蛋白的proteinase活性功能：诱发SOS和促进单链DNA同化。B ATPase的活性第六章 DNA的重组与转座RecA入侵单链被置换连RecA引发链侵入模型第六章 DNA的重组与转座RecA启动的单链入侵第六章 DNA的重组与转座RecA引起的链交换和 Holliday结构的生成 1.2.3 与重组相关的酶 RecBCD（外切核酸酶）和 Chi 位点 具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、序列特异性的单链内切酶活性。 单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链 RecA的作用位点 RecBCD有固定切割位点第六章 DNA的重组与转座 RecBCD的识别和切割位点a、 RecBCD结合在DNA的平头末端（产生机制不清楚）b、外切、解链、移动（ATP）c、兔耳状 loop 结构产生 （再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD 在 loop 单链区的chi 位点3方46nt处切断单链（单链内切酶） chi位点：GCTGGTGG目前发现的重组热点E.coli 含 1000 个.1.2.3 与重组相关的酶 RuvA,RuvB和RuvCRuvA四聚体形成的 结构像四个花瓣的花。Ruv AB复合物结合于 Holliday联结体的模型第六章 DNA的重组与转座（左）RuvA四聚体结合到Holliday位点；(RuvA 识别 Holliday 结构的连接点)（中）RuvB六聚体结合到杂合双螺旋的两对面，DNA穿过 其 中心， RuvB六聚体的作用像马达，促进超螺旋分叉点通 过复合体移动。(具有ATPase活性)（右）RuvC结合到Holliday位点，由其核酸酶活性切断核酸 链，切割位点由剪切体辨认。（ RuvC 核酸内切酶）RuvA/RuvB的作用第六章 DNA的重组与转座1 DNA的重组1.2 位点特异重组发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间的重组原核生物：噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组特征 在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接-产生精确的DNA重排 都具有整合作用的两个基本特征a、典型的保守性重组-交换是相互的和保存原先的DNAb、发生在DNA短同源序列的专一性核苷酸上真核生物： 专一性抗体基因的构建第六章 DNA的重组与转座A、重组位点反方向位于同一DNA分子，重组结果发生倒位。 B、重组位点同方向位于同一DNA分子，重组发生切除；位于不同分子，重组发生整合第六章 DNA的重组与转座1.2.1 phage的整合与切除1 DNA的重组1.2 位点特异重组 整合机制均是通过:细菌DNA和DNA上特定位点之间的重组 重组整合的特定位点-附着位点（attachment site att） E.coli attB 含BOB三序列 phage attP 含POP三序列 核心序列 “O”完全一致（同源部分）-位点特异性重组发生的地方 B,B,P,P-臂第六章 DNA的重组与转座整合过程 整合过程需要整合酶（integrase,Int）和寄主的整合宿主因子IHF（integration host factor）共同作用第六章 DNA的重组与转座整合过程 整合后的附着位点为 attL（BOP）attR（POB） 整合位点-attB、attP切除位点-attL、attR 核心序列O全长15bp，富含A-T 发生在O内的重组交换位点相距7bp 整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同) attP位点的负超螺旋为重组所必须-加强了Int和IHF的亲和力-高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构 Int结合-核心序列的反向位点（切割位置）-结合在att臂上（臂与核心区靠近）第六章 DNA的重组与转座 整合分子机制Xis第六章 DNA的重组与转座 整合分子机制 整合体及其作用整合体（intasome）-Int和IHF结合到attP时的复合物 整合体捕获attB说明-a、attB和attP的最初识别靠Int识别两序列的能力b、两序列的同源性在链交换时为重要因素 Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，进而使holliday结构拆分 重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交 整合与切除的控制整合 C-促使阻遏蛋白C的产生-与int基因的PI结合，转录产生Int蛋白-且PI位于xis基因内，C与PI结合导致xis基因失活切除 寄主SOS反应时-RecA大量产生，促使阻遏蛋白C的水解-把OL和O