基因工程的一般过程与技术1、据图1-4说出基因工程的基本过程。2、认真阅读13页图1-6，讨论：目的基因是什么？受体细胞是什么？基因表达产物是什么？土壤农杆菌在其中可能起什么作用？（一）、从基因文库中获取将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导 入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有 这种生物的不同的基因，称为基因文库。一、目的基因的获取基因文库像“图书馆” 每个基因是一本书从自然界已有物种中分离用人工的方法合成什么是基因文库？基因文库的种类有哪些基因组文库含有一种生物全部基因像国家图书馆部分基因文库含有一种生物部分基因像市图书馆 如cDNA文库基因文库的构建过程基因组文库提取某生物体内全部DNA 限制酶若干DNA片段 分别与运载体连接若干重组运载体 分别导入受体菌在受体菌中储存起来部分基因文库某生物发育某时期mRNA (多种） 反转录多种互补DNA 也称为cDNA 分别与运载体连接 导入受体菌群中储存起来可以看出：基因文库的构建过程类似于基因工程的操作程序强调1、基因组文库只有一种，cDNA文库有许多种 。 2、 cDNA文库构建过程中，mRNA取自发育某时期，不是所有的mRNA，为什么？ 3、基因文库的构建过程类似于基因工程的操作 程序补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点， 并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并 以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚 合酶也从DNA模板链上脱落下来。不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质 编码区非编码区原核 细胞 的 基因 结构 有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。 启动子补：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做 内含子启动子终止子编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 真核 细胞 的 基因 结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞真核细胞 不同点编码区是 _的编码区是间隔的 、_的相同点都由能够编码蛋白质的_和具 有调控作用的_区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思 考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核 细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区 非编码比较基因组文库与cDNA文库文库大小基因中启动子基因中终止子基因中内含子所含基因多少如何从基因文库中得到所需的目 的基因？P9 选择题可能会考查一、目的基因的获取化学合成法已知目的基因表达出的蛋白 质的氨基酸序列 推测mRNA中碱基序列 推测DNA碱基序列 原料、化学合成目的基因反转录法目的基因转录成的mRNA (一种） 反转录酶单链DNA 双链DNA（目的基因 ）（二）、人工合成DNA聚合酶比较：反转录法与cDNA文 库的建立（ mRNA的种类 ）获取真核基因一般采用人工合成法思考：若将真核基因导入原核生物，应除去目的基因的哪个结构？内含子一般用什么方法获取目的基因？ 人工合成课本P11：如果基因较小，核苷酸序列 已知，可直接用DNA合成仪人工合成。看提纲表格（修改“鸟枪法”）1、概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术 2、原理：_聚合酶链式反应 体外特定DNA片段DNA复制（三）、利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的获取（不能填“碱基互补配对”）3、前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列， 以便根据这一序列合成引物引物模板DNAdCTP dATP dGTP dTTP热稳定DNA 聚合酶（Taq酶） DNA解链引物结合到 互补DNA链Taq酶从引 物起始进行 互补链合成加热至7075加热 至9095冷却 至 5560 4、过程（总结）：a、DNA高温变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_b、低温复性（55-60）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部_。 c、中温延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 从引物的 5端3端延伸，合成与模板互补的_。 氢键单链DNA双链DNA链5、条件：_、_、 _(做启动子)、 _、 .6、结果：以_方式扩增，即_（n为循环的次数）使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸引物DNA聚合酶指数2n思考：为什么说PCR技术可以提取出相应的目的基因，而不是简单的复制？模板比较：PCR技术与DNA复制1.用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。2.用_切断目的基因，使其产生_。二、基因表达载体的构建 核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制性核 酸内切酶黏性末端同一种限制性核 酸内切酶的黏性末端切口 DNA连接酶相同质粒DNA分子限制酶处理一个切口 两个黏性末端两个切口 获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种4.过程:二、基因表达载体的构建基因表达载体的组成： 目的基因+启动子+终止子+标记基因它们有什么作用？二、基因表达载体的构建基因表达载体的 构建是不是千篇 一律的，有差别 ？思考从cDNA文库中获取的目的基因、反转录法 合成的目的基因，有没有启动子和终止子？没有这就需要谁必须有启动子和终止子？运载体补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点， 并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并 以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚 合酶也从DNA模板链上脱落下来。不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质 编码区非编码区原核 细胞 的 基因 结构 有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。 启动子补：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶 结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做 内含子启动子终止子编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 真核 细胞 的 基因 结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞真核细胞 不同点编码区是 _的编码区是间隔的 、_的相同点都由能够编码蛋白质的_和具 有调控作用的_区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思 考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核 细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区 非编码三、将目的基因导入受体细胞转化 方法将目的基因导入 植物细胞将目的基因导入 动物细胞将目的基因导入 微生物细胞农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法显微注射法用钙离子处理细 胞（感受态细胞）目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程受体细胞 稳定表达1、将目的基因导入植物细胞 （1）农杆菌转化法双子叶植物中常用方法（2）基因枪法 （3）花粉管通道法单子叶植物常用的转化方法，成本较高我国独创的转化方法 如：我国的转基因抗虫棉三、将目的基因导入受体细胞书P16注意：受体细胞是 ：体细胞或受精卵显微注射技术（1）注入的是是转基因动物中采用最多、最有效的 一种将目的基因导入动物细胞的方法。2、将目的基因导入动物细胞三、将目的基因导入受体细胞（2）受体细胞为含有目的基因的表达载体受精卵注意步骤用原核细胞作为受体细胞的原因？ 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等大肠杆菌应用最为广泛大肠杆菌细胞最常用的转化方法： Ca2+处理细胞感受态细胞重组表达载体 DNA溶于缓冲液中与感受态细胞混合在一 定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子 完成转化过程。3、将目的基因导入微生物细胞三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定是检查基因工程是否成功的一步（一）首先要检测转基因生物染色体上的DNA上是否插入了目的基因 检测方法是 采用DNA分子杂交技术DNADNA（二）其次，还需要检测目的基因是否转录出了mRNA这是检测目的基因是否发挥功能的第一步检测方法是 采用分子杂交技术DNAmRNA应用了 DNA探针技术应用了 DNA探针技术四、目的基因的检测与鉴定（三）再次，还需要检测目的基因是否翻译出了蛋白质这是检测目的基因是否发挥功能的第二步检测方法是 采用抗原抗体杂交法检查是否成功分子水 平检测 个体生物 学水平鉴 定检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原-抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分 子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补 的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合 在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序 列的部位，仍然是两条游离的单链。 四、目的基因的检测与鉴定