DNA的复制与转录DNA的复制过程n中心法则n中心法则的主要内容n中心法则的补充和再思考n逆转录nRNA模板n蛋白质的自身构象调控nDNA的半保留复制n实验证据n15N标记DNA的复制n正在复制的DNA观察n半保留复制的定义nDNA复制过程中，双链解开成两条单链，然后分别以两条单 链为模板在DNA聚合酶催化下，合成两条与模板互补的单链 ，新合成单链与模板链相互配对形成DNA双螺旋分子，子代 DNA含有一条亲代DNA链和一条新合成链，称半保留复制nDNA复制的起始和复制方向n复制子n基因组中独立进行复制的最小单位，称复制子n一个复制子应包含复制起点、复制终点n复制起点nDNA上的特定序列，一般含较多的A/T对，反向重复，具有进 化保守性n有特殊的蛋白质识别起始序列n一般原核生物只有一个复制起点，而真核生物的染色体有多个 复制起点n对于原核生物的质粒，复制起点的性质与其拷贝数相关n复制方向n大多数生物的复制是双向的，接近对称的n现在认为应该存在复制终点nDNA复制的一般过程nDNA双螺旋的打开n拓扑异构酶解除DNA的超螺旋n拓扑异构酶I，断裂并重连接一条DNA单链，不消耗ATPn拓扑异构酶II，断裂并重连接两条DNA单链，在引入超螺旋时耗能nDNA解旋酶将DNA双链打开n每解开1对碱基需要水解2ATPn解旋酶的ATP酶活性必须有DNA单链的存在n转录激活作用n在复制开始前由RNA聚合酶，合成一小段RNA分子n作用主要在于分离DNA双链n少数情况，这段分子可以加成后形成复制引物（ColE质粒）n单链DNA与单链结合蛋白（SSB）作用，避免重新闭合或酶解n不能帮助解旋n原核SSB有协同效应，真核一般没有nDNA复制的引发n参与复制引发体形成的蛋白因子nDNA解链所需的因子（前述）ni 蛋白、n、n、n蛋白ndnaB、dnaC蛋白n引发酶（引物合成酶）n引发过程nn、n、n蛋白与DNA单链结合ndnaB与6个dnaC组成复合体n复合体通过 i 蛋白与n、n、n蛋白组成引发前体n引发前体与引发酶组成引发体n引发体沿模板链5 3 移动n移动到一定位置，即开始合成RNA引物，一般几个到十几个核苷 酸，合成方向也是5 3 n随着复制体的移动，新的DNA双链产生，形成复制叉结构， 双向复制的复制叉，形成大致对称的结构。nDNA的半不连续复制n新生成DNA的合成方向始终是53的，DNA的双链却是反向平行 的，这就产生了其中一条DNA单链的复制方向与复制叉移动方向相 反的问题n实验证明：复制方向与复制叉移动方向相反的DNA单链，并不是连 续合成的，而是先形成一些小的、不连续的DNA片断，再通过DNA 连接酶连接起来。这些片断称为冈崎片断，这样的复制方式称为半 不连续复制。n连续合成的DNA链一般称前导链，不连续合成的DNA链称滞后链。n冈崎片断产生的原因n引发体先在前导链上合成一段引物，后转移到滞后链n复制叉移动一段距离后，在滞后链模板上的引物酶合成出引物，DNA 聚合酶结合，开始延伸DNA，由于方向与复制叉移动方向相反，延伸 一段距离后， DNA聚合酶与DNA分离。n由于复制叉不断移动，滞后链不断合成引物，上述过程不断重复，形成 冈崎片断n原核冈崎片断一般10002000bp、真核冈崎片断一般100-200bpnDNA聚合酶n大肠杆菌一般有3种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶I、II 、III，分别行使不同的功能，DNA的复制主要由DNA聚合酶 III催化nDNA聚合酶I：多功能酶，需Mg2+、Zn2+n5 3核苷酸聚合作用，以四种脱氧核苷三磷酸为原料，需要单 链模板，必须有引物游离3-OH存在n3 5核酸外切酶作用， 校对作用。n3 5焦磷酸解作用n5 3核酸外切酶作用。切除引物、损伤修复n磷酸盐与焦磷酸基的交换nDNA聚合酶IIIn7种亚基构成全酶n功能与DNA聚合酶I相似，但活性更高n亚基为催化亚基，亚基具有校对功能，、 、构成核心酶n亚基为引物识别和模板定位亚基，全酶结合后释放n亚基使酶可以利用长的DNA单链n、亚基称为延长因子nDNA聚合酶IIn没有5 3核酸外切酶作用n其他参与DNA复制的酶nDNA连接酶：催化相邻的核苷酸之间3，5磷酸二酯键的形成 ，以NADH或ATP供能n尿嘧啶糖苷酶、dUTP酶、AP核酸内切酶nDNA复制的准确性的保障nDNA聚合酶的校对作用n引物的切除和空缺修补n未配对单链的切除n真核DNA复制与原核的对比n五种DNA聚合酶：、。 相当于原核的聚合酶III, 在DNA的延伸中起作用。n核小体的“全保留复制”：前导链保有全部的原核小体，滞后链 则全部重新合成n末端问题：端粒n其他DNA复制方式n滚环复制：单向复制的一种特殊形式n单链开环n开环后，5端游离，或固定在膜上n以完整的环DNA为模板，在单链DNA的3-OH端延伸，推动 环一边滚动一边分离出线状的DNA单链，直到重新合成出完 整的DNA分子n线状DNA单链再复制环化n多重DNA复制n一次复制结束前，下一次复制即开始n逆转录过程n定义：n由逆转录酶催化，以RNA为模板合成DNA的过程，是遗传信 息由RNA传递到DNA的过程n某些致癌的RNA病毒、HIV病毒、乙肝病毒有逆转录酶活性n逆转录酶n以四种脱氧核苷酸为底物，以RNA为模板在有引物存在的前 提下，聚合形成DNA，需要Mg 2+、Mn 2+n引物可以是寡聚核糖核酸，也可以是寡聚脱氧核糖核酸，长度 4bpn是多功能酶n以RNA为模板，聚合形成DNAn以DNA为模板，聚合形成DNAn切除DNA-RNA杂合分子中的RNA分子n逆转录过程n病毒的RNA分子类似于真核mRNA的结构n一般携带一分子宿主的tRNA分子作为引物n以病毒的RNA分子为模板合成DNA分子，形成杂合分子n降解RNA分子，再以DNA分子为模板复制，形成DNA双链n环化进入细胞核，并整合到宿主的基因组中，进行表达n逆转录的生物学意义n中心法则的重要补充n致癌病毒的复制方式，对于相应的疾病的治疗有指导意义n基因工程中遗传信息的重要获得方式n基因治疗的重要工具n生物进化研究的突破nDNA复制的调控n顺式调控作用nDNA序列的调控作用n反式调控作用n蛋白因子的调控作用DNA的转录过程n原核生物的转录作用nRNA聚合酶n多亚基酶：、n无需引物存在n可转录mRNA、tRNA、rRNAn转录起始n启动子：RNA聚合酶识别，结合，并开始转录的一段DNA序 列n-35序列：TTGACA, 识别、结合部位n-10序列：TATAAT, DNA局部解链部位n转录起点n转录因子：参与转录的蛋白因子n转录促进因子n阻遏蛋白nRNA的延伸n生成的RNA链先与DNA链结合形成杂合双链n游离出RNA单链n可以内部配对形成一定的结构n转录的终止n终止子：提供转录停止信号的DNA序列，终点前一般有一段 回文序列，转录后形成发夹结构n不依赖于rho因子的终止子：形成发夹结构，回文对称序列有一 段富含G/C对的序列，终点前转录形成有富含U的序列n依赖于rho因子的终止子：没有富含G/C对的序列，也没有富含U 的序列，由于发夹结构的存在，使RNA聚合酶的移动速度下降， rho因子追赶上RNA聚合酶，引发终止过程n终止因子nrho因子：帮助RNA聚合酶与DNA分离，帮助RNA释放nNUS因子： NusAn抗终止作用n真核生物的转录作用nRNA聚合酶：三种nRNA聚合酶I：转录45S rRNA(5.8S, 18S, 28S)nRNA聚合酶II：转录hnRNA ，SnRNAnRNA聚合酶III：转录tRNA、5s rRNAn真核启动子nHogness框（TATA框）：-25-30，一般7bp，几乎全部由T/A 构成nCAAT框：-75位，9bp，GGTCAATCTnGC框：更上游，GGGCGG，转录因子结合部位n真核转录因子n以非组蛋白的形式与染色质结合n形成不同的功能相应元件n核质因子、核功能蛋白n转录过程的调节控制n原核生物的转录调控n操纵子模型：操纵子是由功能上相互关联的基因和基因表达控 制结构组成的基因结构单位，可以实现对代谢过程调节控制， 以乳糖操纵子为例：n结构基因：-半乳糖苷酶，-半乳糖苷透性酶，-半乳糖苷转乙 酰酶n操纵基因：可以和阻遏蛋白可逆的结合，控制结构基因的表达， 与结构基因构成操纵子n调节基因：可以表达出阻遏蛋白参与操纵子的调控n操纵子的调节过程n当没有乳糖分子存在的时候，阻遏蛋白与操纵基因结合，阻止乳 糖操纵子表达n一旦有一定浓度的乳糖分子存在，则乳糖分子与阻遏蛋白结合 使阻遏蛋白变构，从操纵基因上分离，结构基因表达，乳 糖分解n乳糖被利用而浓度下降，阻遏蛋白重新与操纵基因结合，结构基 因停止表达n诱导型操纵子和阻遏型操纵子n色氨酸操纵子n原核转录的其他调控方式n降解物阻遏n衰减作用n时序控制n真核生物转录的调控n染色体结构在转录中作用n核小体结构n高表达活性DNAn转录因子的作用n增强子n真核生物或病毒染色体，有一些DNA序列，对基因转录起增强 作用，有时甚至是必不可少的，称为增强子n增强子与效应基因之间可以有很远的距离，可以在效应基因的上 游或下游，但一般只作用于同一条DNA分子上的启动子n转录的抑制物n放线菌素Dn利福平：原核n-鹅膏蕈碱：真核nRNA转录后的加工nrRNA的加工n原核rRNA的加工n30 S rRNA前体的甲基化n30 S rRNA前体17 S、25 S中间物和一个tRNA分子n17 S、25 S中间物16 S、23 S rRNAn5 S rRNA, 来自于30 S rRNA前体的3端n真核rRNA的加工n45 S rRNA前体的甲基化n切除间隔生成18 S、28 S、5.8 S rRNAntRNA的加工n原核tRNA的加工n裁切n去3-端附加顺序n加上3-端CCAn内部碱基修饰n真核tRNA的加工n切去5，3 端附加序列n逐个加上3 端CCAn核苷酸修饰n2-O-甲基核糖n真核mRNA的加工n5端帽子的加工nhnRNA 5 端的三磷酸嘌呤核苷脱磷酸n与GTP生成5，5三磷酸连接n以S-腺苷酰甲硫氨酸提供甲基，实现甲基化n3端polyA的加工n切去原3端片断n多聚腺苷酸聚合酶催化形成polyA尾n内含子切除n在snRNA辅助形成剪接体：U1U6n内含子“套索支序列”：CURAYn5-剪接点磷酸基团与“套索支序列”中A的2-羟基形成2，5-磷酸 二酯键同时释放5的外显子n外显子1的3-OH与外显子5-磷酸基团形成3，5-磷酸二酯键n套索内含子释放(DnaB)Sliding clampsubunits3 5 exonuclease subunitsClamploader腺嘌呤腺嘌呤Promoter specificityEnzyme assembly,Enzyme assembly, promoter recognition,promoter recognition, activator bindingactivator bindingRole unknownRole unknown (not needed (not needed in vitroin vitro) )151151 15515511 11 kDakDa(32-90 (32-90 kDakDa) )The footprint- protein+ proteinr-independent terminator: a modelPalindrome DNA sequencesStem-loop(hairpin) structureGC boxCAAT box