辛伐他汀辛伐他汀对心衰心肌细胞肌浆对心衰心肌细胞肌浆 网钙泵的影响网钙泵的影响苏州大学附属第一医院苏州大学附属第一医院：曲辅政曲辅政 指导教师指导教师：刘志华教授刘志华教授一研究背景一研究背景 慢性心力衰竭是临床常见病、多发病，因致死慢性心力衰竭是临床常见病、多发病，因致死 率、致残率高，一直是临床研究重点。当今国率、致残率高，一直是临床研究重点。当今国 内外对慢性心力衰竭病理生理的研究更多集中内外对慢性心力衰竭病理生理的研究更多集中 于兴奋收缩的钙循环环节。钙循环过程主要包于兴奋收缩的钙循环环节。钙循环过程主要包 括肌浆网（括肌浆网（SRSR）钙释放、钙回摄、钙储存三个）钙释放、钙回摄、钙储存三个 过程。过程。 正常情况下，心肌舒张期正常情况下，心肌舒张期SERCA2aSERCA2a（肌浆网钙泵）将大部分（肌浆网钙泵）将大部分 钙离子回摄到肌浆网储存，钙离子回摄到肌浆网储存， SERCA2aSERCA2a的调节包括直接调节和的调节包括直接调节和 间接调节。间接调节。 CaMKCaMK（钙调蛋白依赖性蛋白激酶（钙调蛋白依赖性蛋白激酶)发挥直接发挥直接 调节作用，调节作用，PLBPLB（受磷蛋白）发挥间接调节作用；（受磷蛋白）发挥间接调节作用；PLBPLB去磷酸去磷酸 化时与化时与SERCA2aSERCA2a结合，抑制了结合，抑制了SERCA2aSERCA2a对钙离子的亲和力对钙离子的亲和力 ，而，而PLBPLB磷酸化后与磷酸化后与SERCA2aSERCA2a解离，解离，SERCA2aSERCA2a对钙离子的对钙离子的 亲和力增加亲和力增加, ,对钙离子的回摄能力提高。对钙离子的回摄能力提高。PLBPLB有有3 3个磷酸化位点个磷酸化位点 ，即丝氨酸，即丝氨酸-16-16、苏氨酸、苏氨酸-17-17、丝氨酸、丝氨酸-10-10位点；但主要发挥作位点；但主要发挥作 用的是丝氨酸用的是丝氨酸-16-16位点。丝氨酸位点。丝氨酸-16-16位点由位点由PKAPKA( (蛋白激酶蛋白激酶A)A)磷磷 酸化、酸化、 PP1PP1（磷酸酶（磷酸酶11）去磷酸化。）去磷酸化。 心衰时心肌细胞心衰时心肌细胞SERCA2aSERCA2a表达及活性有无变化，其变化的机表达及活性有无变化，其变化的机 制是什么制是什么? ?他汀类药物用于慢性心力衰竭治疗，可改善心功能他汀类药物用于慢性心力衰竭治疗，可改善心功能 ，减轻心力衰竭症状，减轻心力衰竭症状。对肌浆网钙泵有何影响对肌浆网钙泵有何影响? ?目前国内外文目前国内外文 章鲜见报道。章鲜见报道。 通过观察辛伐他汀对心衰心肌细胞通过观察辛伐他汀对心衰心肌细胞PLBPLB、 SERCA2aSERCA2a、CaMKCaMK、PKAPKA、PP1PP1的表的表 达以及达以及SERCA2aSERCA2a功能、功能、PKAPKA、CaMKCaMK活活性的影响，探讨心力衰竭的分子生物学机性的影响，探讨心力衰竭的分子生物学机 制以及辛伐他汀改善心力衰竭的分子生物制以及辛伐他汀改善心力衰竭的分子生物 学机制。学机制。二研究目的二研究目的三研究方法三研究方法1 1 研究对象：研究对象：18只家兔，雌雄不拘，分为3组： 假手术组6只，心力衰竭组 6只，辛伐他汀干预组 6只(术后即予辛伐他汀10mg/kg/d，至实验结束)。2.实验方法： 2.1：心衰模型的建立（主动脉瓣损伤+腹主动脉缩窄法）： 用戊巴比妥麻醉家兔，从右侧颈总动脉用 4F导管破坏主动脉瓣。 2周后，进行腹主动脉缩窄。用戊巴比妥麻 醉，打开腹腔，在肾动脉上方，将腹主动脉缩 窄50%左右。 观察指标：包括呼吸、活动、进食、紫绀 情况。药物对左室重构的影响心脏超声观察心脏变化，观察指标：左房 内径、左室舒张末径、左室收缩末径、室间隔厚 度、左室后壁厚度、射血分数、左室缩短率。解剖学观察药物对心室重构的影响：观察 心脏重量、左心室重量、心脏重量指数、左室重 量指数。血液动力学观察：观察左室舒张末压、左 室收缩末压。2.2 RT-PCR检测心肌组织PLB、SERCA2a mRNA表达: 抽提mRNA 逆转录 扩增 SERCA2a 正义引物：F-TGAATAAACCGCCTCGG；反义引物：R-CAGCACCATCAGCCACT；PLB 正义引物：F-ACTTCCCAGCTACAAGCCCA；反义引物：R-CTGATGTGGGAAATGACGGA； -actin 正义引物：F-CTTCTCCTTGATGTCCCGCACGAT ；反义引物：R-GTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGG ；扩增条件为94预变性4min，然后进入PCR循环,94 变性30s，55退火30s，72延伸1min，循环35次再延伸 7min。SERCA2a、PLB与-actin扩增片段长度分别为464 、368、231bp。电泳图像分析 2.3 Western blot检测心肌细胞膜SERCA2a 、细胞浆CaMK、PKA、PP1蛋白表达: 提取心肌细胞膜、细胞浆蛋白； 用BCA法测定蛋白浓度； Western blot分别检测心肌细胞膜 SERCA2a蛋白、细胞浆CaM、CaMK、PKA 、PP1蛋白表达。2.4 -32P底物掺入法测定CaMK、PKA的活性: 提取细胞浆蛋白；用BCA法测定蛋白浓度；按按CaMKCaMK、PKA检测试剂盒说明检测试剂盒说明测定二者的活性。2.5 无机磷酸根法测定SERCA2a活性:制备肌浆网；用BCA法测定蛋白浓度；按试剂盒说明按试剂盒说明测定SERCA2a的活性。2.6 利用光谱荧光检测技术测定肌浆网的摄钙能力:制备肌浆网；用BCA法测定蛋白浓度；测定肌浆网的摄钙能力。计算公式 Ca2+=Kd（RtRmin）/（Rmax Rt） Sf2/Sb23 统计分析各组测得数值均以Xs表示，组间均数比较采用ANOVA检验 （SAS6.12版本），P0.05为统计学有显著差异。4.结 果4.1 3组观察开始时LAd、IVSD、LVIDd、LVIDs、LVPwd 、FS 、EF比较：3组家兔手术前 LAd、IVSd、LVPwd、LVIDd、LVIDs 、 FS及EF无明显差别（p0.05） 4.2 3组观察终止时LAd、IVSD、LVIDd、LVIDs、LVPwd 、FS 、EF比较：观察终止时心衰组LAd、IVSd、LVPwd、LVIDd、LVIDs较假手术组明显增加（ P0.05），而他汀组以上参数较心衰组明显降低（P0.05）；心衰组FS及EF较假手术组 明显降低（P0.05），而他汀组FS及EF较心衰组明显增加（P0.05）4.3 3组血流动力学结果比较：3组家兔手术前血流动力学无明显差别；观察终止时，心衰组HR、LVESP和 LVEDP较假手术组明显增加（P0.05）；而他汀组以上参数较心衰组明显降低（ P0.05）4.4 3组心脏、左心室、心脏重量指数 、左室重量指数比较：心衰组家兔心脏外观较假手术组明显增大，且心脏重量、左室重量及心脏重量指数 、左室重量指数明显增加（P0.05）；而他汀组以上参数明显低于心衰组（P0.05）4.5 三组心肌组织SERCA2a mRNA表达比较：表1-6：三组心肌组织SERCA2a mRNA表达比较注：与假手术组比较*P0.05；与心衰组比较P0.05。心衰组的SERCA2a mRNA水平显著低于假手术组，而辛 伐他汀组的SERCA2a mRNA水平明显高于心衰组。 心衰组组辛伐他汀组组假手术组术组灰度比 0.700.04*0.860.021.060.16家兔7周后SERCA2a mRNA的表达比较图1-1图1-24.6 三组心肌组织PLB mRNA表达比较：表1-7：三组心肌组织PLB mRNA表达比较注：与假手术组比较*P0.05；与心衰组比较P0.05。心衰组的PLB mRNA水平显著低于假手术组，而辛伐他汀 组的PLB mRNA水平明显高于心衰组。 心衰组组辛伐他汀组组假手术组术组灰度比 0.810.04*0.960.061.120.07家兔7周后PLB mRNA的水平表达比较图1-3图1-44.7 三组心肌组织SERCA2a蛋白表达比较：表1-8：三组心肌组织SERCA2a蛋白表达比较注：与假手术组比较*P0.05；与心衰组比较P0.05。心衰组的SERCA2a蛋白水平显著低于假手术组，而辛伐 他汀组的SERCA2a蛋白水平明显高于心衰组。 心衰组组辛伐他汀组组假手术组术组灰度比 0.690.04*0.870.031.020.02 家兔7周后SERCA2a蛋白的表达比较图1-5 图1-64.8三组心肌组织CaMK蛋白表达比较：表1-9：三组心肌组织CaMK蛋白表达比较注：与假手术组比较*P0.05 ；与心衰组比较P0.05 。可见心衰组心肌细胞CaMK表达显著高于假手术组，辛伐他汀组显著低于心衰组。 心衰组组辛伐他汀组组假手术组术组灰度比 1.450.13*1.160.060.890.05 家兔7周后CaMK蛋白的表达比较 图1-7 图1-84.9 三组心肌组织PKA蛋白表达比较：表1-10：三组心肌组织PKA蛋白表达比较注：与假手术组比较*P0.05 ；与心衰组比较P0.05 。可见心衰组心肌细胞PKA表达显著低于假手术组，辛伐他汀组显著高于心衰组。心衰组组辛伐他汀组组假手术组术组灰度比 0.610.03*0.780.071.051.050.08 0.08 家兔7周后PKA蛋白的表达比较图1-9图1-104.10 三组心肌组织PP1蛋白表达比较：表1-11：三组心肌组织PP1蛋白表达比较注：与假手术组比较*P0.05 ；与心衰组比较P0.05 。可见心衰组心肌细胞PP1表达显著高于假手术组，辛伐他汀组显著低于心衰组。心衰组组辛伐他汀组组假手术组术组灰度比 1.250.06*0.810.090.390.390.07 0.07 家兔7周后PP1蛋白的表达比较 图1-11图1-124.11 三组心肌组织CaMK活性比较：表1-12：三组心肌组织CaMK活性比较可见心衰组CaMK活性明显高于假手术组，辛 伐他汀组CaMK活性显著低于心衰组。心衰组组辛伐他汀组组假手术组术组 CaMK活性 (pmol/min/g ) 3.540.17*2.830.142.182.180.13 0.13 图1-13注：与假手术组比较*P0.05；与心衰组比较P0.05。4.12 三组心肌组织PKA活性比较：表1-13：三组心肌组织PKA活性比较可见心衰组PKA活性明显低于假手术组，辛 伐他汀组PKA活性显著高于心衰组。心衰组组辛伐他汀组组假手术组术组 PKA活性 (pmol/min/g ) 1.090.09*1.440.041.851.850.05 0.05 图1-14注：与假手术组比较*P0.05；与心衰组比较P0.05。4.13 肌浆网囊泡的电镜图像：图115 4.14 三组心肌组织SERCA2a活性比较：表1-14：三组心肌组织SERCA2a活性比较可见心衰组SERCA2a活性明显低于假手术组，辛伐他 汀组SERCA2a活性显著高于心衰组。心衰组组辛伐他汀组组假手术组术组 SERCA2a活性 (molPi/mgp/h) 8.320.15*11.810.6315.0115.011.00 1.00 图1-16注：与假手术组比较*P0.05；与心衰组比较P0.05。4.15 三组心肌细胞肌浆网摄钙能力比较：表1-15：三组心肌细胞肌浆网摄钙能力比较可见心衰组肌浆网摄钙能 力明显低于假手术组，辛伐 他汀组肌