第十二章细胞融合与单克隆抗体第一节 概述抗体是指能与相应抗原特异 性结合具有免疫功能的球蛋白 。抗体的产生：机体免疫系统 受抗原刺激后，B淋巴细胞被活 化增殖和分化为浆细胞，由浆 细胞合成和分泌的球蛋白。20世纪60年代发现多发性骨髓 瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性 疾病。病人血清中出现同抗体结构 类似的球蛋白， 统称为免疫球蛋 白（immunoglobulin，Ig）。所以 Ig是化学结构的概念，而抗体是生 物学功能的概念。多克隆抗体：病原微生 物含有多种抗原决定簇的抗 原物质，因此这些抗体制剂 也是多种抗体的混合物，故 称多克隆抗体。 1975年Kohler和Milstein首先 利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出 单克隆抗体（monoclonal antibody McAb）。单克隆抗体具有高度特异性、 均一性、来源稳定、可大量生产等 特点，为抗体制备和应用提供了全 新的手段，还促进了基础和临床医 学的发展。单克隆抗体作为抗体制剂， 在临床上主要用与疾病的诊断和 治疗。单克隆抗体检测与某些疾病 有关的抗原，辅助临床诊断。用 放射性核素标记单克隆抗体进行 肿瘤显像，做免疫定位诊断。单克隆抗体用于临床治疗， CD3单克隆抗体作为免疫抑制剂 对器官移植免疫排斥有抑制作 用。以单克隆抗体作为载体的药 物对肿瘤进行定向治疗。第二节 单克隆抗体单克隆抗体是将抗体产生细 胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤 细胞相融合，通过有限稀释法及 克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的 单克隆细胞系而产生的。杂交瘤技术的实验原理及其操作演示 接受抗原刺激后，能接受抗原刺激后，能分泌分泌针对该抗原的针对该抗原的特异性特异性抗体抗体，在体液免疫中具有重要功能。，在体液免疫中具有重要功能。B B淋巴细胞本身是一种淋巴细胞本身是一种终末分化细胞终末分化细胞，通常不再，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡短命短命细胞细胞一、杂交瘤技术产生的一、杂交瘤技术产生的3 3个技术关键个技术关键1. B1. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B B淋巴细胞淋巴细胞(B lymphocytes)(B lymphocytes)：骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 ( (myelomamyeloma cells): cells):恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活永远分裂和存活长命细胞长命细胞。经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株没有抗体分泌物。没有抗体分泌物。2. 2. 细胞融合技术：细胞融合技术：脾细胞脾细胞 (B(B淋巴细胞淋巴细胞) )骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞长命长命 不分泌抗体不分泌抗体分泌抗体分泌抗体 短命短命分泌抗体分泌抗体 长命长命KhlerKhler和和Milstein, 1975Milstein, 1975 19841984年年NobelNobel医学奖医学奖3. 3. 杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选 ：脾细胞脾细胞 (B(B淋巴细胞淋巴细胞) )骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞脾细胞/ / 脾细胞脾细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞/ / 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞脾细胞筛选出筛选出不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活HATHAT培养基筛选培养基筛选H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶DNADNA内源性途径内源性途径( (主要途径主要途径) )谷氨酰胺谷氨酰胺 oror 单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 AAHHT T外源性途径外源性途径( (旁路途径旁路途径) ) ( (HHypoxanthine ypoxanthine g guznineuznine p phosphohosphor ribosylibosyl t transferaseransferase) ) 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( ( HGPRT HGPRT ) )胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶 ( ( TK TK ) ) ( (T Thymidinehymidine k kinaseinase) )B B淋巴细胞淋巴细胞： HGPRTHGPRT+ +， TKTK+ +骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞： HGPRTHGPRT- -， TKTK- -存活存活死亡死亡外源性途径外源性途径( (旁路途径旁路途径) )二、杂交瘤技术的操作流程1. 1. 动物免疫：动物免疫：目的：目的：在细胞融合后获在细胞融合后获 得尽可能多的分得尽可能多的分 泌针对于该目标泌针对于该目标 抗原的特异性抗抗原的特异性抗 体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞. .特定特定目标抗原目标抗原动物动物免疫免疫脾脏中脾脏中B B淋巴细胞淋巴细胞B B淋巴细胞大量增殖淋巴细胞大量增殖刺激刺激能分泌针对于该抗能分泌针对于该抗 原的原的特异性抗体特异性抗体常规免疫法常规免疫法脾内一次性免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法短程免疫法体外免疫法体外免疫法 常用免疫方法：常用免疫方法：“稳妥；优势克隆稳妥；优势克隆”皮下注射皮下注射 腹腔注射腹腔注射 静脉注射静脉注射免疫途径：免疫途径：“省时；省抗原省时；省抗原”“省时省时”“操作繁琐操作繁琐”常规免疫法：常规免疫法：第第1 1次免疫：抗原次免疫：抗原+ +福氏完全佐剂福氏完全佐剂第第2 2次免疫：抗原次免疫：抗原+ +福氏不完全佐剂福氏不完全佐剂第第3 3次免疫：抗原次免疫：抗原+ +不加佐剂不加佐剂第第4 4次免疫：抗原次免疫：抗原+ +不加佐剂不加佐剂( (皮下注射或静脉注射皮下注射或静脉注射) )( (皮下注射皮下注射) )( (皮下注射皮下注射) )( (静脉注射静脉注射) )二、细胞融合及二、细胞融合及HATHAT筛选筛选uu病毒介导的细胞融合病毒介导的细胞融合uuPEGPEG介导细胞融合介导细胞融合uu电激融合电激融合1 1、细胞融合方法：、细胞融合方法：细胞悬液的制备与融合细胞悬液的制备与融合 (1) (1) 脾细胞悬液的制备：脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第最后一次免疫后第3 3天制备天制备 (2) (2) 骨髓瘤细胞悬液的制备：骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备于对数生长期制备 (3) (3) 细胞融合：细胞融合：50%PEG(10004000)50%PEG(10004000), pH8.0, 38, pH8.0, 38o oC, 1minC, 1min2 2、HATHAT培养基的筛选培养基的筛选融合后细胞混合液融合后细胞混合液HATHAT培养基培养基2 weeks later2 weeks laterHTHT培养基培养基正常培养基正常培养基1 week later1 week later三、抗体的检测三、抗体的检测要求：要求： 简便、快速、敏感简便、快速、敏感; ; 在短时间内能检测大量样品在短时间内能检测大量样品常用方法：常用方法：pp酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法(enzyme-linked (enzyme-linked immunosorbentimmunosorbent assay, ELISA) assay, ELISA)pp间接免疫荧光法间接免疫荧光法(Indirect (Indirect immunofluorescenceimmunofluorescence, IFA), IFA)pp放射免疫法放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)(radioimmunoassay, RIA)pp双相扩散法双相扩散法酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法(ELISA)(ELISA)抗原抗原第第1 1抗体抗体酶酶第第2 2抗体抗体待检杂交瘤培养上清液待检杂交瘤培养上清液底物底物有色产物有色产物酶标仪检测酶标仪检测技术原理：技术原理：四、克隆化四、克隆化常用克隆化方法：常用克隆化方法：有限稀释法有限稀释法软琼脂平板法软琼脂平板法显微操作法显微操作法uu8080个细胞个细胞/96/96孔孔uu饲养细胞饲养细胞(feeder cells)(feeder cells)ELISAELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即 为为单克隆抗体单克隆抗体。由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对 于一个抗原决定簇于一个抗原决定簇单克隆抗体单克隆抗体(monoclonal (monoclonal antibody, antibody, MAbMAb) )单克隆抗体单克隆抗体(monoclonal antibody, (monoclonal antibody, MAbMAb) )单克隆抗体优点：单克隆抗体优点： 高度纯一高度纯一 高度专一高度专一应用：应用： 疾病的论断和治疗疾病的论断和治疗( (生物导弹生物导弹) ) 生物大分子的鉴定、定位和分离纯化生物大分子的鉴定、定位和分离纯化 细胞器的鉴定、定位和分离细胞器的鉴定、定位和分离 特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离五、大规模培养五、大规模培养批量生产单克隆抗体批量生产单克隆抗体常用的大规模培养方法：常用的大规模培养方法：动物接种法动物接种法转瓶培养法转瓶培养法细胞培养罐法细胞培养罐法培养上清中培养上清中X X抗体的检测抗体的检测 克隆化培养克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中X X抗体的检测抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养规模化培养 获得大量单克隆抗体获得大量单克隆抗体动物免疫动物免疫 细胞融合细胞融合 混合细胞的混合细胞的HATHAT筛选筛选) ) 分泌分泌X X抗体抗体 B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞X X抗原抗原B B淋巴细胞淋巴细胞 瘤的突变株瘤的突变株培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡 无限生长细胞无限生长细胞 分泌分泌 X X抗体抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/cBALB/c杂交瘤技术操作流程图解杂交瘤技术操作流程图解洗脱液洗脱液支持物支持物被分离物质被分离物质被分离物的抗体被分离物的抗体其它物质其它物质亲亲 合合 层层 析析 原原 理理 图图 解解一、抗原与动物免疫制备特定抗原的单克隆抗体，首 先要制备用于免疫的适当抗原，再用 抗原进行动物免疫。有的抗原可以用化学合成：地高辛多数抗原物为混合物须经免疫、筛 选、克隆化。为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系 动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多 来自BALB/c小鼠和 LOU大鼠，因 此免疫动物也采用相应的品系。免疫的方法采用体内免疫法和 体外免疫法。体内免疫法适用于免疫原性强 、抗原量较多时应用，一般用812 周龄雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌细胞抗原 ）的免疫原性强，可不加佐剂，直 接注入腹腔10个细胞进行初次免疫 ，间隔13周，再追加免疫12次 。7可溶性抗原按每只小鼠10100g 抗原与福氏完全佐剂等量混合后注 入腹腔内，进行初次免疫，间隔 24周，再用不加佐剂原抗原追加 免疫12次。 一般再采脾细胞前3日由静脉注射最 后一次抗原。刺激B细胞分裂。脾内免疫法即在麻醉下直接将0.10.2ml抗原注入脾脏进行 免疫。细胞抗原需105个，可溶 性抗原需10g。体外免疫法用于不能采用体 内免疫的情况下，如制备人源性 单克隆抗体；免疫源性极弱，易 引起免疫抑制。优点：需抗源量少，免疫期短， 干扰因素少。体外免疫法：用48周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加 入适当抗原使其浓度达0.