第十四章 遗传病的诊断 p188学习要求掌握：染色体检查适应症。P191基因诊断的概念/特点/基本途径。P194熟悉：系谱分析的注意事项. P190了解：遗传病生化检查的适应症。遗传病的诊断临床医生根据患者的症状、体征及各种检查结果和遗传学分析，从而确认其是否患某种遗传病，并判断其遗传方式和遗传规律称遗传病的诊断。遗传病的诊断；除应用一般疾病(非遗传病)的方法、技术外，还必需应用遗传学的技术和方法；如家系分析、染色体检查、酶和蛋白质检查、基因分析等。临床医生不仅要有丰富的临床经验，还要有掌握遗传学的理论、技术和方法。依遗传病诊断的时间不同分： 一般800-1200ml)的孕妇。 夫妇之一有致畸因素(射线、药物)接触史的孕妇。 有AR遗传病家族史，又近亲结婚的孕妇。已出现先兆流产、妊娠时间过长、有出血倾向的孕妇不宜做产前诊断。 产前诊断的技术和方法B超B超是一种安全无创的检测方法，能够详细检查胎儿的外部形态和内部结构，使许多遗传性疾病得到早期诊断。 可诊断疾病有; 神经管缺陷、脑积水、无脑畸形；唇裂、腭裂，颈部淋巴管肿瘤；先天性心脏病，支气管及肺发育异常、胸腔积液。其他的异常，如先天性单侧肾缺如，先天性幽门狭窄、先天性巨结肠等。 羊膜穿刺羊膜穿刺是在B超的监视下，有经验的医生用消 毒的注射器抽取胎儿羊水（图图）。羊膜穿刺一般在妊娠1620周进行，流产的风 险相对较小。抽取的羊水进行生化检测；胎儿脱落细胞培养后进行生化检测、染色体分析或基因检测。如；羊水中甲胎蛋白浓度过高时，提示胎儿可 能有无脑、开放性脊柱裂、脊髓脊膜膨出和脑积水等异常。 孕1620周羊水取样示意图耻骨与肚脐连线1/2处进针,抽取15-20ml 。绒毛取样法妊娠79周进行，是早期诊断方法。在B超监视下，用特制取样器，从阴道经宫颈进入子宫，沿子宫壁到达取样处，吸取绒毛(图图)。优点；时间早，需作选择性流产时，孕妇损伤和痛苦较小。缺点；取样操作要求高，易污染，胎儿、母体易 感染，流产风险是羊膜取样的两倍。 范围；诊断染色体病，遗传性酶病，性别鉴定及 可做基因诊断的所有遗传病。孕79周绒毛取样法示意图脐带穿刺术在B超监视下，用细针经腹壁、子宫进入胎儿脐带抽取胎儿血液。取样最好在妊娠18周，常用于因错过绒毛取样或羊膜取样最佳时机或羊水检查失败的补救措施。可检测胎儿血液系统疾病，先天性代谢缺陷病及某些单基因病。 胎儿镜检查(羊膜腔镜镜或宫宫腔镜镜)它可在羊膜腔直接观察胎儿外形、性别和发育状况及有否畸形。还可抽取羊水或胎血检查及宫内治疗。因此，理论上这是一种最理想的方法。但因操作困难，易引起并发症，目前还不被广泛采用。胎儿镜最佳检查时间妊娠1820周，可诊断大疱性表皮松懈症及某些皮肤病。 分离孕妇外周血中的胎儿细胞前述产前诊断材料的获得对于胎儿和母体都有创伤，存在流产和感染风险。20世纪90年代末，利用胎儿细胞可通过胎盘屏障进入母体血液中，用流式细胞仪分离技术，磁激活细胞分选技术，免疫磁珠法，显微操作分选法，分离胎儿细胞。该法富集的胎儿细胞很少，需用高灵敏的技术方法进行一步分析检测，常用方法PCR。 植入前诊断随着体外受精，试管婴儿和胚胎移植技术的开展，以及单细胞基因诊断技术的应用，目前正探索胚胎植入前的诊断技术。体外培养的4-8细胞胚胎或受精后6天胚胎着床前，用显微操作技术取出一个细胞，应用PCR等技术进行特定基因和染色体畸变的检测，将人类遗传缺陷掌控在最早阶段。是遗传病产前诊断的重大突破。二、病史、症状与体征1病史：主要采集与遗传遗传 病有关项项目：(1)家族史:患者父、母家系中各成员员健康状况。(2)婚姻史:婚龄龄、次数、配偶及配偶家系健康状况，特别别注意是否有近亲结亲结 婚。(3)生育史: 育龄龄、健康及患病子女数，有无流产产、死产产、早产产、畸胎等历历史。2症状与体征遗传遗传 病常表现现特异症状和体征：（1）特异性症候群： 遗传遗传 病的症状与体征常许许多关联联性状并列出现现。如；与智力低下相关的疾病(PKU、半乳糖血症)，PKU的特殊性状尿臭可区别别于其它疾病。（2）绝绝大多数遗传遗传 病可见见形态学改变(畸形)。（3）多数遗传遗传 病有早期症状，如发发育迟缓迟缓 等。（4）遗传病的最后确诊，需遗传学的特殊诊断。三、系谱分析1群体普查： 某时间对时间对 某一群体进进行某些遗传遗传 病发发病率调查调查 。样本要求：占地区人口1/101/100，10万人。2家系调查：对患者1、2、3级亲属发病率的调查。 3系谱分析： 经过经过 回顾顾性分析以确定疾病遗传遗传 方式。系谱分析时的注意事项； （1）系统、完整：至少收集三代或更多代资资料，力求详细详细 、准确。如；死因、死胎、流产产、新生儿死亡、夭折、有无近婚、重婚、非婚生子女、半同胞、养子女及嫁出和嫁入者的家族资资料等。（2）去伪存真：与患者沟通要热热情、耐心、有同情心以取得信任。要讲讲明意义义，晓晓以利害，并进进行必要的核查查。(3)系谱分析时要考虑全面：遗传方式、单基因遗传、线粒体遗传、多基因遗传、遗传异质性、外显不全、延迟显性、限性显性、从性显性、遗传印记、动态突变，以及散发病例的新基因突变引发等。特别是有遗传异质性的疾病；如耳聋，50%-单单； AR占43.5%; AD占6.5%; XR0.5%; 环环境占30%；特发发占20%。先天性白内障；10%单单基因(多AD)、20%染色体畸变变、25%宫宫内感染、34%特发发。第二节 细胞遗传学检查 核型分析是确诊染色体病的主要方法。家族中有智力发育不全、先天畸形(生殖器畸形)、生殖能力异常(不育、闭经、多发性流产)的个体以及确认染色体异常者或携带者时均宜检查染色体。如; 发育迟缓：常见1q与11p相互易位。乳腺癌的多种染色体异常t(1q;11q)染色体检查适应征 有下列情况之一的应建议其作核型分析 有多个出生缺陷患者的家系。 习惯性流产的夫妇双方。 可疑是先天愚型的个体及其双亲。 X或Y染色质数目异常者。 体态和精神发育异常并伴有先天畸型者。 卵巢或睾丸发育不全者。 原发性闭经，女性不孕和男性不育者。 外生殖器两性畸形者。 身材高大(1.80以上)且性格粗暴者。 恶性血液病 (慢粒、急淋等)患者。性染色质检查(X/Y染色质质)：针对两性畸形或性染色体数目异常疾病而进行的检查，可作为染色体检查的一种辅助手段。易取材(口腔上皮、发根毛囊)、时间短、费用低、易接受。第三节蛋白质水平诊断(生化检查) P193常见疾病的生化检查苯丙酮尿症粘多糖病枫糖尿症白化病中间代谢 产物血清（）苯丙氨酸缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸尿（）苯丙酮酸 苯乙酸硫酸皮肤素 硫酸乙肝素 硫酸角质素酮衍生物缺陷酶酶活性（）苯丙氨酸羟化 酶支链酮酸羧 化酶酪氨酸 酶酶检测采样部 位肝肝 白细胞 成纤维细胞毛囊以生化手段定性、定量地分析患者的酶和蛋白质。临床诊断单基因病首选法，最常用检测酶的缺陷。第四节 基因诊断 直接检查基因结构，对被检查者是否有基因缺陷做出状态和疾病的诊断。简简悦威(YW Kan 1978)首次用DNA重组组法进进行HbS产产前诊诊断，目前临临床上普遍开始试试用基因诊诊断技术术。可做基因诊诊断疾病已达4000余种 (包括亚亚型)。基因诊诊断的出现现，使对对疾病的诊诊断模式由表型诊诊断过过渡为为基因型诊诊断或称逆向诊断。基因基因型表型生化分析仅在发病前或产前对少数遗传病做诊断.因待测物是蛋白质、酶或激素等基因的产物，而基因表达有个体发育的阶段性和组织特异性, 故局限了疾病检测的类型。基因诊断则不受限制，任何来源的有核细胞, 基因的组成是一致的(免疫球蛋白基因、T细胞受体基因、肿瘤细胞例外)。基因诊断特别适用于生化分析无法确诊遗传病。 如；PKU，生化检测需取肝组织来测定苯丙氨酸羟化酶活性，因无法取得胎儿的肝组织细胞而不能做产前诊断。基因诊断直接以基因为探测对象，可用所有有核细胞为标本。PKU可取绒毛或羊水细胞进行诊断。一、基因诊断的特点 直接检测基因结构基因型表型。逆向诊断改变变了传统传统表型诊诊断模式，可在发病前，产产前和对对携带带者做出准确诊诊断，并不受时间时间、细细胞类类型、年龄龄限制。因基因诊断的特点:针对性强、特异性高、灵敏度高、适应性广。 以特定基因为目标，检测基因变化，特异性强。 分子杂交和PCR技术具有信号放大作用，微量样品即可进行诊断，灵敏度高。 在疾病尚无临床表现前和产前，以及特定人群的筛查等，针对性强。 检测样品获得便利，不受个体发育阶段性和基因表达与否限制，适应广泛。基因突变具多样性，除缺失、 倒位、点突变、动态突变可进行基因检测外，大多数基因突变的分析复杂而繁琐，有较高的难度。 二、基因诊断的基本途径2、致病基因未知或不清的-间接诊断分直接诊断和间接诊断两种；1、致病基因已知的疾病-直接诊断使用基因本身或紧邻的DNA序列为探针，检测有无突变、缺失等异常。致病基因不清时，不能直接检测，可采用DNA多态性标记的检测法，利用已知多态性遗传标记与疾病的连锁关系间接诊断疾病。（2）基因突变诊断举例 RFLP对PKU(AR)的基因诊断用克隆的PAH基因(苯丙氨酸羟化酶)做探针，Southern杂交：用3种限制酶(MapI、SphI)对7个PKU家系进行长长度片段多态态性(RFLP)分析。Msp酶切显示；仅有19kb片段是患者, 说明19kb片段与PKU致病基因连锁 。含23kb片段者正常；同 时时有19kb和23kb是携带带者。1 2 1 2M23/M19 M23/M19 S9.7/S7.0 S9.7/S7.03 4 3 4M19/M19 M23/M23 S9.7/S9.7 S7.0/S7.0Msp酶切 Sph酶切23kb 11kb19kb 9.7kb7.0kb1 2 3 4 1 2 3 4SphI酶切结结果显显示; 9.7kb片段与致病基因 连锁连锁，7.0Kb正常，仅仅 有9.7kb片段是患者。现现在对对PAH基因已有了更深入了解，它位于12q22-24.1，长约长约90kb，PKU的基因诊诊断就不仅仅限于使用RFLP法，也可用SSCP技术术直接检测检测基因的突变变。在高加索人中已发现发现40多种由点突变变及缺失引起的PAH突变变基因，在中国PKU患者中检检出了14种点突变变。2、血友病A的基因诊断 血友病A是凝血因子(F)基因缺陷，主要为碱 基取代或碱基缺失、插入，这些突变产物是不完整、无活性或不稳定F肽链，故临床症状轻重不一。基因诊断法可检出有部分缺失的患者和女携带者。产前基因诊断可通过RFLP连锁分析。目前多采用PCR与RFLP相结合方法，先用 PCR技术 将包含突变DNA片段扩增，然后用识别该位点的限制 酶来酶解，电泳后直接检测多态性位点的状态。1 2 1 2 3 4 5 6 75/5 5/- 5/5 5/20 5/- 5/20 20/- 5/- 20/ -20Kb - - - -5 Kb - - - - - - -AB上图可知；母亲是5.0和20杂杂合体；6得到5.0片段是患者，7得到20片段正常；说说明5.0是带带致病基因