第七章第七章基因分析的基本基因分析的基本策略策略同济大学医学院再生医学系 生物化学与分子生物学教研室 2013.11基因分析技术能帮助我们干什么？基因分析技术能帮助我们干什么？zz揭示生物大分子揭示生物大分子(DNA(DNA、RNARNA、蛋白质、蛋白质) )的结构与功能的结构与功能yyDNADNA 水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位yyRNARNA 水平：定量分析水平：定量分析yy蛋白质蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功能水平：蛋白质定量、定位、功能yy细胞细胞与与整体整体水平：基因在活体中的功能水平：基因在活体中的功能zz目的：了解疾病发生的规律，目的：了解疾病发生的规律，提供临床疾病的诊断和治疗预防手段提供临床疾病的诊断和治疗预防手段我们需要了解和掌握哪些基本技术？我们需要了解和掌握哪些基本技术？zzPCR PCR 技术：技术： yy特定核酸序列的扩增与定性、定量分析特定核酸序列的扩增与定性、定量分析 zz分子杂交与印迹技术：分子杂交与印迹技术： yy特定核酸序列的定性、定量、定位分析特定核酸序列的定性、定量、定位分析 zz基因测序技术：基因测序技术： yy了解基因或基因组序列及其变异了解基因或基因组序列及其变异 zz蛋白质分析技术：蛋白质分析技术： yy蛋白质等定性、定量、定位、相互作用和功能研蛋白质等定性、定量、定位、相互作用和功能研 究究p PCR技术原理 p 做PCR的条件 p PCR的应用一、聚合酶链式反应一、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)zzPCRPCR，polymerase chain reactionpolymerase chain reactionyy在体外选择性扩增特定在体外选择性扩增特定 DNA DNA 片段的高效手段片段的高效手段zz7070 年年代代有人提出有人提出 PCR PCR 的设想，因缺乏寡核苷酸的设想，因缺乏寡核苷酸 的合成手段和适合的酶而无法进行的合成手段和适合的酶而无法进行zz1984 1984 年年 Kary Mullis Kary Mullis 发明发明 PCRPCR，并因此获得并因此获得 1993 1993 年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖zz全自动的热循环仪和多种全自动的热循环仪和多种 PCR PCR 衍生技术使其称衍生技术使其称 为重要的科学研究手段为重要的科学研究手段61983年春， Kary Mullis提出DNA反复复制的设想 加热使双链DNA模板变性为单链， 降温使单链DNA与引物结合（退火）， 加入DNA聚合酶延伸引物合成新的DNA。 Kary Mullis1. PCR 1. PCR 的基本原理的基本原理zz在体外，以特定在体外，以特定引物引物引引 导，通过导，通过 DNADNA 聚合酶聚合酶 选择性扩增特定区域选择性扩增特定区域 zz变性变性( (denaturedenature) )zz退火退火( (annealanneal) )zz延伸延伸( (extensionextension) )DNA的生物合成（ DNA复制）PCR技术原理变性延伸退火DNA模板 引物 dNTP DNA聚合酶 Mg2+PCR是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚 合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外 扩增技术。 主要热循环过程：变性、退火、延伸。94 55 72 x40cycle PCR仪12PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析500bp 400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkersPCR产物PCR PCR 技术的特点技术的特点zz高度的灵敏性高度的灵敏性：理论上经：理论上经 20 20 循环可将目的基因片段循环可将目的基因片段 扩增扩增 2 220201000000 1000000 倍倍zz高度的特异性高度的特异性：利用引物与模板的特异性配对，可：利用引物与模板的特异性配对，可 保证扩增的特异性保证扩增的特异性 yy一对一对 20 20 碱基长引物的多样性为碱基长引物的多样性为4 4404010102424zz应用的广泛性应用的广泛性：目前已经成为分子生物学研究必不：目前已经成为分子生物学研究必不 可少的手段可少的手段zz操作的简便性操作的简便性：不需要复杂的设备和繁琐的流程：不需要复杂的设备和繁琐的流程2. 2. 做做 PCR PCR 要有什么条件？要有什么条件？zz酶酶：Taq DNA Taq DNA 聚合酶聚合酶zz模板模板 DNADNA：可以为基因组可以为基因组 DNA DNA 或或 cDNAcDNAzz引物引物：人工合成的寡核苷酸片段：人工合成的寡核苷酸片段 zzdNTPdNTP：聚合反应的核苷酸单体聚合反应的核苷酸单体zz缓冲液：包含特定的缓冲液：包含特定的 pHpH、离子强度和离子强度和 MgMg2+2+zz反应程序：变性、退火、延伸组成的循环反应程序：变性、退火、延伸组成的循环 zz仪器：仪器：DNA DNA 热循环仪，或称热循环仪，或称 PCR PCR 仪仪(1) (1) 什么是什么是耐热耐热 DNA DNA 聚合酶聚合酶? ?zz早期早期 PCR PCR 曾曾使用使用 DNA DNA 聚合酶聚合酶 I Iyy在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶yy延伸反应温度为延伸反应温度为 37 37，非特异性太多，非特异性太多zz目前常用目前常用 Taq DNATaq DNA 聚合酶聚合酶yy纯化自嗜热水生菌纯化自嗜热水生菌 ( (Thermus aquaticusThermus aquaticus) )yy可耐受可耐受 95 95 高温，最适反应温度为高温，最适反应温度为 72 72 左右左右Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerasezz在在 7075 7075 范围活性最佳，每秒可延伸范围活性最佳，每秒可延伸 150 150ntnt zz9595 时的半衰期为时的半衰期为 40 40 minmin yy按变性时间按变性时间 1 1 min min 计，能满足计，能满足 30 30 循环的反应循环的反应 zzTaq Taq 酶具有酶具有 5 5 3 3 聚合活性和聚合活性和 5 5 3 3 外切活性外切活性 zz不具备校读活性不具备校读活性，错误率为，错误率为 210 2104 4 左右左右 yy错误合成的错误合成的 DNADNA片段可以作为模板，循环数越片段可以作为模板，循环数越 多，最终扩增产物错误率越高多，最终扩增产物错误率越高 yy只能用于检测，不适合基因克隆只能用于检测，不适合基因克隆有有保真性保真性的的耐热耐热 DNA DNA 聚合酶聚合酶吗？吗？zzPfuPfu DNA polymerase DNA polymerase：yy常用的高保真耐热常用的高保真耐热 DNADNA聚合酶聚合酶yy有有5 5 3 3 外切外切活性活性yy错误率约错误率约 110 1106 6yy适应于基因克隆适应于基因克隆 实验室常用：实验室常用：Takara Takara PrimeSTAR HS DNA PolymerasePrimeSTAR HS DNA Polymerase TianGen TianGen Pfu DNA PolymerasePfu DNA Polymerase NEB NEB Phusion PolymerasePhusion Polymerase Invitrogen Invitrogen Platinum PfxPlatinum Pfx(2) (2) 如何设计如何设计寡聚核苷酸引物寡聚核苷酸引物？zz引物引物( (primerprimer) )是是 PCR PCR 反应必备的前反应必备的前提提，对，对 PCR PCR 产物产物 类型、长度和反应的特异性具有决定作用类型、长度和反应的特异性具有决定作用 zzPCR PCR 需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段 长度长度引物设计引物设计软件软件Primer Premier 5.0 (Primer Premier 5.0 (自动搜索设计引物）自动搜索设计引物） Oligo 6Oligo 6（引物评价）（引物评价） Primer ExpressPrimer Express（实时定量（实时定量PCRPCR引物）引物） DNASTARDNASTAR Primer3 (Primer3 (在线服务）在线服务）应用实例应用实例 -PCR-PCR引物设计及相关软件使用引物设计及相关软件使用引物设计原则引物设计原则zz引物长度一般为引物长度一般为 1530 1530 核苷酸核苷酸 yy引物太短引物太短影响杂交体的稳定和特异性影响杂交体的稳定和特异性 yy引物太长引物太长随机匹配序列增随机匹配序列增多多，特异性，特异性反而下降反而下降 zzGC GC 含量一般为含量一般为 45 45 55 55 yy应充分考虑应充分考虑退火温度退火温度( (annealing temperatureannealing temperature) )xxGC GC 含量低，退火温度低，易出现非特异含量低，退火温度低，易出现非特异 xxGC GC 含量高，非特异性含量高，非特异性结合结合也会增加也会增加 yy简便简便计算公式：计算公式：退火温度退火温度4(4(GGC)C)2(A2(AT)T)引物设计原则引物设计原则zz引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现发引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现发 卡结构卡结构zz两条引物间不应存在互补序列两条引物间不应存在互补序列yy出现互补易导致引物二聚体的出现，影响扩增效率出现互补易导致引物二聚体的出现，影响扩增效率引物设计原则引物设计原则zz避免引物与非特异序列间的同源性避免引物与非特异序列间的同源性zz引物的引物的 3 3，末端必末端必须须与模板完全互补与模板完全互补，5 5，末端允许末端允许添加非配对序列添加非配对序列 yy5 5，末端允许添加非匹配序列末端允许添加非匹配序列，如：，如：酶切位点酶切位点具体引物设计过程具体引物设计过程l l一般引物设计一般引物设计 l l测序引物设计测序引物设计 l l5 5端引入限制性内切酶位点或标记引端引入限制性内切酶位点或标记引 物设计物设计 l l兼并引物设计兼并引物设计 l l特殊需求引物设计特殊需求引物设计Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 使用介绍使用介绍主要功能主要功能: : 1 1、即引物设计、即引物设计 2 2、限制性内切酶位点分析、限制性内切酶位点分析 3 3、DNADNA基序基序(motif)(motif)查找查找 4 4、同源性分析、同源性分析Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0使用介绍使用介绍(1)(1)Preimer Premier 启动界面Load sequenceSequence name Original sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好Choose a function 基本信息基本信息引物设计界面引物设计界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful