人促红细胞生成素在 CHO细胞上的表达 魏霄雲哈尔滨师范大学生命科学与技术学院生物制药促红细胞生成素的理化性质 EPO是由165个氨基酸组成的高糖基化蛋 白质，去唾液酸或去糖基化不影响重组人 EPO的体外生物活性，但却缩短了在体内 的半衰期，使其完全丧失了在体内的活性 ，说明糖基对其生物活性是至关重要的， 因此基因工程的EPO不能利用原核表达系 统，只能利用哺乳动物细胞表达系统（如 CHO细胞）生产关于EPO 人促红细胞生成素是一种由肾脏产生的高 度糖基化蛋白,是红系细胞发育过程中最重 要的调节因子。天然存在的EPO药源极为 匮乏,须从贫血病人尿中提取,不能满足社会 的需要。1985年Jacob等成功地从胎儿肝 中克隆出EPO基因,使通过基因工程手段大 量生产重组EPO成为可能。关于EPO 国外用人促红细胞生成素gDNA(genomic DNA)在哺乳动物细胞中已获得高效表达,而 在我国虽也有重组产品问世,但存在表达水 平偏低,生产成本偏高的问题,不能满足大规 模工厂化生产和临床应用的需要,因此迫切 需要提高EPO在细胞中的表达量。 为此,我们开展了EPO在CHO细胞中的表达 研究,希望能获得比较理想的效果。实验目的： 获得人促红细胞生成素(EPO)的高效 表达 三、实验仪器及耗材 实验试剂与器材 氨甲喋呤(MTX)、煌焦油蓝购于Sigma公 司;rHuEPO体内生物学活性测试工作标准 品为Amgen公司产品;Lipofectamine、犊 牛血清、F12与D-MEM细胞培养基购自 Gibco/BRL公司;EPO ELISA kit购自 Boehringer Mannheim公司;96孔与24孔 细胞培养板为Costar产品。三、实验仪器及耗材 实验材料 菌株 DH5,JM109均由本实验室保存。质粒 质粒pD、p38(内含EPO gDNA)由本实验 室保存,pcDNA3购自Invitrogen公司,pSV40dhfr 由Paul Berg实验室构建,本实验室保存。 工具酶 各种限制性内切酶均购自华美生物工程 公司,T4 DNA连接酶与牛小肠碱性磷酸酶购自 Gibco/BRL公司, DNA聚合酶I大片段(Klenow)购 自Promega公司三、实验仪器及耗材 细胞株 CHO-dhfr-细胞由本室保存。 实验动物 雌性BALB/c小鼠,68周龄。方法 以EPO gDNA为基础构建了两个真核表达载体 pDE、pCE,将它们分别经脂质体转染CHO-dhfr- 细胞,其48 h瞬时表达量分别为275 ng/ml与 8890 ng/ml。然后用氨甲喋呤(MTX)对转染细胞 进行加压并挑选细胞克隆,共获得3株高效表达 EPO的工程细胞株A,B,C,其中A来自质粒pCE,B 和C来自pDE,在210-6mol/L的MTX的压力下,它 们48 h的最高表达水平分别为 A:87g/mlB:1076g/ml,C:1644g/ml。 经网织红细胞法测得它们均具有体内生物活性。网织红细胞计数 (一)原理 网织红细胞是晚幼红细胞脱核后但 尚未完全成熟的红细胞,胞质中尚有核糖体、核糖 核酸等嗜碱性物质残存,经煌焦油蓝或新亚甲蓝活 体染包后,胞质中可见蓝或蓝绿色枝点状甚至网织 状结构。 (二)方法 活体染色法.近年来还可通过某些血液 自动分析仪及流式细胞术检测法进行网织红细胞 计数。 四实验步骤 质粒的转化、酶切、去磷、连接、重组子质粒的 鉴定等基因操作 细胞的转染 按lipofectamine使用说明书进行,在 此过程中质粒要经特定的内切酶线性化,在pCE中 采用Bgl,pDE则采用EcoR,其中质粒pCE要与 经EcoR线性化的质粒pSV40-dhfr共转染。 细胞克隆的筛选 CHO-dhfr-细胞在转染质粒48 h后,经胰蛋白酶消化后进行细胞计数,用F12培养 液将其稀释成1104cells/ml,置37CO2培养箱 中培养,当细胞形态恢复正常后,换用D-MEM培养 液置CO2培养箱中继续培养,约15d后出现肉眼可实验步骤 见的细胞克隆此时可用弯头吸管挑取细胞克隆至 96孔细胞培养板中培养,同时在培养液中添加 MTX,其初浓度为110-8mol/L,以每10 d为一个周 期,倍比地提高MTX的浓度。在适当的时候将96 孔板内的细胞转入24孔细胞培养板中,然后再转入 30 ml细胞培养瓶中培养,至此细胞克隆工作即告 完成。在挑选克隆的过程中,应挑取加压后表达水 平提高较明显的细胞株,而非一开始表达量较高的 细胞。 细胞表达上清中EPO含量的检测 采用Boehringer Mannheim公司的EPO ELISA kit EPO生物活性的测定 采用网织红细胞计数法五实验结果 1真核表达载体pDE、pCE的构建 将质粒p38经Sal酶切后,回收长为24 kb 的EPO gDNA片段,除EPO蛋白编码区外,其5非 翻译区长120 bp,3非翻译区长200 bp。同时将真 核表达载体pD、pcDNA3分别用Sal、Hind 线性化,线性化的pD经CIP去磷后与EPO基因片段 按适当的比例温合连接,获得重组质粒pDE;将线 性化的质粒pcDNA3与EPO基因片段均经Klenow 补平,并且将线性化的pcDNA3经CIP去磷,两者按 适当比例混合后用T4 DNA连接酶连接,得重组质 粒pCE。质粒pCE与pDE的物理图谱如下。实验结果2 瞬时表达结果 将质粒用lipofectamine转染CHO细胞后 48h,收集细胞上清,经PBS稀释100倍后,用 ELISA测定其EPO的浓度,结果见表1。3 稳定表达 经MTX筛选后得到的三个高表达细胞株A、B、 C,在MTX的浓度为210-6mol/L时,测定它们48 h 细胞上清中EPO的浓度,样品均用PBS稀释10 000 倍,结果见表2。4 EPO体内生物活性的测定 经过网织红细胞法,测得工程细胞株A,B,C 48 h稳定表达上清中的EPO含有体内生物活 性,其体内活性值分别为 A:8483IU/ml,B:10491IU/ml,C:16029 IU/ml。六讨论 真核基因表达不仅可以生产大量的感兴趣蛋白,而且在 细胞遗传学与生物学中具有广泛的应用,因此研究基因 在真核细胞中的表达具有极其重要的理论及实践意义 。 外源基因在哺乳动物细胞中的表达受许多因素的影响, 如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工 等方面,其中尤以转录水平的调节最为重要。 在细胞中转录水平的调控是由基因的顺式作用元件与 细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现,由 于在特定的细胞内,反式作用因子是固定的,不可改变的 ,因此基因的表达主要取决于其顺式作用元件的作用。对外源基因而言,也就是决定于特定的表达载体中的启 动子,一个合适的启动子可将外源基因的表达水平提高几 倍甚至几十倍。但是对于特定的基因和细胞,各启动子起 始转录的效率有很大的差别,因此我们认为在进行外源基 因的表达研究中,应考虑选用几种不同的强启动子,才有可 能获得较为理想的表达效果。目前外源蛋白在真核细胞中的稳定表达均采用了选择扩 增系统,其中以二氢叶酸还原酶基因扩增系统研究最为清 楚,应用最为广泛。可以通过MTX的渐次加压选择而进行极大地增加外源 基因的拷贝数,从而提高外源蛋白的产量。 有关文献报道认为与dhfr基因共转染的DNA倾向于同 它一起整合于细胞染色体的共同区域,当用MTX进行加 压筛选时,它们将同时进行扩增。但我们的研究表明共 转染时加压效果不明显,这可能是由于它们并未整合于 染色体的相同位点所致。因此我们认为最好选用dhfr基 因与目的基因串联在一起的载体来进行表达,加压效果 较为明显。 我们的表达结果明显高于国内报道的水平,其原因可能 是由于我们采用的是EPOgDNA,因为有关报道认为在 其gDNA的内含子及基因两侧的非翻译区中存在一些对 基因表达具调控作用的元件,它们的存在可明显提高基 因在细胞中的表达量。同时我们采用的载体中dhdfr基 因与EPO基因串联在一起,便于用MTX进行加压扩增。