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三、原核生 物的质粒 定义:是一类小型闭合环状核外双螺旋DNA分子,能独立于细胞核进行自主复制。大小:约为2100106Dalton,上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。性质:可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在(游离态),也可以通过交换掺入染色体上,以附加体(episome)的形式存在;质粒是一种复制子(replicon),根据自我复制能力的不同,可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种,严紧型质粒的复制受细胞核控制,与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个(15)个拷贝;松弛型质粒的复制不受细胞核控制,在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制,在细胞内的数量可以达到10200个或更多。可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到 另一个菌细胞中,使两个细胞都成为带有质粒的细胞;质粒 转移时,它可以单独转移,也可以携带着染色体(片段)一 起进行转移,所以它可成为基因工程的载体。对于细菌的生存并不是必要的功能多样化三、原核生物的质粒功能:进行细胞间接合,并带有一些基因,如产生 毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。重组:在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。 存在范围:很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus 、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等制备:包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和 蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。鉴定:电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶 切图谱等方法三、原核生物的质粒几种代表性质粒:1. F因子(fertility factor):又称致育 因子或性因子,62106Dalton,94.5kb, 相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA ,足以编码94个中等大小多肽,其中1/3基 因(tra区)与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球 菌、链球菌等细菌中,决定性别。Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes. 最初发现于痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae),后来发 现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和 Staphylococcus中。R因子由相连的两个DNA片段组成,即抗性转移因子( resistence transfor factor, RTF )和抗性决定R因子(r -determinant),RTF为分子量约为11106Dalton,控 制质粒copy数及复制,抗性决定质粒大小不固定,从几 百万到100106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗 性基因。R-因子在细胞内的copy数可从12个到几十个,分为严 紧型和松弛型两种,经氯霉素处理后,松弛型质粒可达 20003000个/细胞。2. R因子( resistence factor ) 产大肠杆菌素因子。 大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素,能通 过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它 肠道细菌。其分子量约41048104Dalton。大肠杆菌素 都是由Col因子编码的。 Col因子可分为两类,分别以ColE1和ColIb为代表。ColE1分子量约为5106Dalton,无接合作用,是 多copy的; ColE1研究得很多,并被广泛地用于重组 DNA 的研究和用于体外复制系统上。ColIb分子量约为80106Dalton,它与F因子相似, 具有通过接合作用转移的功能,属于严紧型控制,只 有12个copy。 凡带Col因子的菌株,由于质粒本身编码一种免疫蛋白, 从而对大肠杆菌素有免疫作用,不受其伤害。 3. Col因子(colicinogenic factor)v降解性质粒只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质 粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码,从 而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源 。这些质粒以其所分解的底物命名,例如有 分解CAM(樟脑)质粒,XYL(二甲苯)质粒 ,SAL(水杨酸)质粒,MDL(扁桃酸)质粒 ,NAP(奈)质粒和TOL(甲苯)质粒等。4. 降解 性质粒 即诱癌质粒。 存在于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中,可引起许多双子叶植物的根癌 。当细菌侵入植物细胞中后,在其细胞中溶解,把细菌 的DNA释放到植物细胞中。这时,含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合,破坏控制细 胞分裂的激素调节系统,从而使它转变成癌细胞。 Ti质粒长200kb,是一个大型质粒。当前,Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外 源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中,并进一步使之整合到植物染色体上,以改变该植物的遗传性,达到 培育植物优良品种的目的。 5. Ti质粒(tumor inducing plasmid) 是近年来在Rhizobium(根瘤菌属)中发现的 一种质粒,分子量为200300106Dalton,比一般质粒大几十倍到几百倍,故称巨大质粒,其上 有一系列固氮基因。 6. 巨大质粒(mega质粒)基因:能够表达和产生基因产物 (蛋白质或RNA)的DNA序列 。原核生物基因系统:启动子(基因)操纵子 操纵子(基因) 基因调控系统 结构基因调节基因细胞水平:大部分或全部DNA都集中于细胞核或核质体中,不同种类微生物或同种不同细胞 中细胞核的数目不同 染色体水平:真核微生物的每个细胞核内含有一定数量的 染色体;而原核微生物中一个核质体就是一个裸露的、光学 显微镜下不能看到的环状染色体。一些真核生物和原核生物基因组的比 较生 物 单倍体的分子量 核苷酸 已知染色体数 约数(Da) 对数 基因数人 32 35 1012 57 109 4000黑腹果蝇 4 7.9 1010 8.0 107 50006000 粗糙脉孢菌 7 2.8 1010 4.5 107 500大肠杆菌 1 2.5 109 3.8 106 1027噬菌体T4 1 1.1 108 2.0 105 135噬菌体 1 3.2 107 4.8 104 35 噬菌体MS21 1.1 106 3.5 103 3遗传密码:指DNA链上各个核苷酸的特 定排列顺序 密码子(coden):由3个核苷酸顺序决定,负载 遗传信息的基本单位 不对称转录:只有DNA双链的一股才作为有意义 链被转录,这种现象又称不对称转录。 起始密码子:AUG,甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸 终止密码子:UAA、UGA、UAG核外 DNA的 种类 核外染色 体真核生物 的“质粒”原核生物 的质粒线粒体 细胞质基因叶绿体 (质体)中心体 动 体 共生生物:卡巴颗粒 酵母菌的2m质粒F因子 R因子 Col质粒 Ti质粒巨大质粒 降解性质粒第二节 基因突变和诱 变育种 突变(突变( mutationmutation ):):指生物体的表型突然发生的可遗传的 变化。 染色体畸变细胞学上可以看到染色体的变化 突变 基因突变细胞学上看不到遗传物质的变化 突变体(mutant):发生了突变的微生物细胞或菌株 野生型(wild type):从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株 依表型的改变分为: 形态突变型 营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力 ,并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变 类型。 发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型 抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物 理因子的抗性 条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖 ,而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型 抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变 产量突变型 (一)基因突变 的类型按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分:选择性突变株(selective mutant):具有选择标记(如营养 缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型),只要选择适当的 环境条件,如培养基、温度、pH值等,就比较容易检出和分 离到。非选择性突变株(non-selective mutant):无选择标记(如产量突变型、抗原突变型、形态突变型),能鉴别这种突变 体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。 定义:每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 突变率为108是指该细胞在一亿次细胞分裂中,会发生一 次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突 变株(mutant,即突变型)的数目来表示。如一个含108个细 胞的群体,当其分裂为2108个细胞时,即可平均发生一次突 变的突变率也是108 。 突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数 突变是独立独立的的。某一基因发生突变不会影响不会影响其它基因其它基因的突 变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低 的,因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。 由于突变的几率一般都极低,因此,必须采用检出选择性 突变株的手段,尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株( back mutant或reverse mutant)或抗性突变株特别是抗药性 突变株的方法来加以确定。(二 )突 变率若干细菌某一性状的自发 突变率 菌 名 突变性状突变率 E. coli抗T1噬菌体3 108 E. coli抗T3噬菌体1 107 E. coli不发酵乳糖1 1010 E. coli 抗紫外线1 105 Staphylococcus aureus 抗青霉素1 107 S. aureus 抗链霉素1 109 Salmonella typhi抗25g/L链霉素1 106 Bacillus megaterium 抗异烟肼5 105 (三)突变的特点适用于整个生物界,以细菌的抗药性为例。 不对应性:突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。 自发性:突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。 稀有性:突变率低且稳定。 独立性:各种突变独立发生,不会互相影响。 可诱发性:诱变剂可提高突变率。 稳定性:变异性状稳定可遗传。 可逆性:从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突 变(forward mutation),从突变株回到野生型的 过程则称为回复突变或回变(back mutation或 reverse mutation)。(四)基因突变的自发性和不对应 性的证明 在各种基因突变中,抗性突变最为常见。但在过去相当长 时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。一种观点认为,突变是通过适应而发生的,即各种抗性是由其 环境(指其中所含的抵抗对象)诱发出来的,突变的原因和突变的 性状间是相对应的,并认为这就是“定向变异”,也有人称它为“ 驯化”或“驯养”。另一种看法则认为,基因突变是自发的,且与环境是不相对的 。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素 错综在一起,所以难以探究问题的实质。从1943年起,经过几个严密而巧妙的实验设
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