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血红蛋白与核黄素的凝胶层 析分离电液20104283班 制作人:成洁琴 组员:严文彦 刘秀 柯坤血红蛋白与核黄素血红蛋白1 .结构 :血红蛋白(Hb)是由两对珠蛋白肽 链和 4 个亚铁血红素构成。珠蛋白 4条肽链( 、链);亚铁血红素:原卟啉、铁。 2 .特点 :(1)正常情况下,99%Hb为还原 Hb(HbA),1%为高铁Hb(HbF)。(2) 只有Fe2+状态的Hb才能与氧结合,称为氧和 血红蛋白。(3)在人体生长不同时期,Hb的 种类与比例不同。出生后3个月,HbA95%, 而HbF降至1%以下。(4)血红蛋白合成受激 素(红细胞生成素、雄激素)调节。(5)相 对分子质量为64458。(6)降解产物为珠蛋 白、血红素。核黄素维生素B2,又称核黄素,维他命B2。它是人体 必需的13种维生素之一,作为维生素B族的成 员之一,微溶于水,可溶于氯化钠溶液,易溶 于稀的氢氧化钠溶液。维生素B2是机体中许多 酶系统的重要辅基的组成成分,参与物质和能 量代谢。 分子式: C17H20N4O6 分子量: 376.37 熔点: 290 水溶性: 0.07 g/L (20) 比旋光度: -135 实验目的(1)掌握凝胶层析的原理。 (2)掌握柱层析的基本装置。 (3)熟悉凝胶层析的操作过程。层析技术层析技术的概念:任何层析都有两层:固定相与流动相,两相互不溶。u 固定相由层析介质组成,可以是固体或液体。这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附,溶解于交换作用, 对层析的分离效果起关键作用。u 流动相只在层析过程中推动固定相上待分离的物质朝着一定方向移 动的液体或气体。柱层析中流动相一般被称为洗脱剂。它也是层析中的 重要影响因素之一。 层析法的特点: 分辨力高 分析效率高 灵敏度 应用广泛局限性: 在定量分析中需要纯制的标准物质 不能精确地解决物质的化学结构问题凝胶层析常用的层析方法:吸附层析分配层析离子交换层析亲和层析凝胶层析:是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术,又称之凝胶过滤 ,分子筛层析或排阻层析。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载 体,不带电荷,吸附力弱,操作条件比较温和,可在相当广的温度范围 下进行,不需要有机溶剂,对于高分子物质有很好的分离效果。 本实验要求用Sephadex G-25( G-25型交联葡聚糖凝 胶) 凝胶层析柱将血红蛋白与核黄素的混合液分离 ,并测出洗脱曲线。实验原理凝胶层析原理 凝胶层析柱中装着许多直径小于1mm的凝胶颗粒,颗粒内部不是实心的 ,而是呈三维多孔网状结构。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时 ,大分子物质因其直径大于凝胶网孔的孔径,不能进入凝胶颗粒内部,只能 沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动,流程短而速度快先流出层析柱。小分子物 质由于其分子直径小于网状结构的孔径,可进入凝胶颗粒内部,受到来自凝 胶珠内部的阻力,所以流程长而移动速度慢。因此,大的蛋白质直接通过凝 胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要 取决于要纯化的蛋白质分子量。 实验器材与试剂(一)器材1.2cm x 40cm层析柱、1ml微量可调式 移液器、 721E型分光光度计、恒压贮液瓶、自动部分收集器(二)试剂(1)葡聚糖凝胶Sephadex G-25. (2)血红蛋白与核黄素的混合液。(3)洗脱液:0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.3) 或生理盐水实验操作(1)凝胶处理l 将sephadex g-25凝胶干粉放入过量水中浸泡24h或沸 水水浴2h。浸泡后,搅动凝胶再静置,待凝胶沉积后,倾 去上层细粒悬液,如此反复多次。 (2)层析柱的预备用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程中不能使 用毛刷,以免擦伤层析柱子内壁,影响层析分离效果。固 定好层析柱各处的接口,用水检查层析柱各处的接口密封 性。将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出 口的聚乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气 泡,待气泡排出后,使溶液在底部留至35cm高既可关闭 出水口。 柱层析示意图3)装柱将处理好的凝胶在烧杯内用1倍提及的洗脱液搅拌成悬浮液,自柱 顶部沿管内壁缓缓加入柱中。待底部凝胶沉积至5cm左右时,缓缓打开 低端出口管,随之继续缓慢添加凝胶悬浮液直至凝胶体积沉积至25cm 高度为止。操作中注意防止气泡与节痕产生。(4)平衡 装好后,使层析床稳定510min,然后接上高位贮液 瓶,打开出口活塞,调节高位贮液瓶的高度,控制流 速为1ml/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平衡, 使层析床稳定.操作过程中应特别注意:在平衡与洗脱时要将高 位贮液瓶至层析柱的连接管内的气泡全部排出,以免 影响流速;恒压高位贮液瓶内玻璃管底端出口高度 之差不能大于40cm,以免影响流速;平衡过程中 务必防止层析床液体流干。防止层析床液体流干最简 单的方法是使连接高位贮液瓶与层析柱之间的导管形 成U形,U形管底部低于层析柱的出口;如果需要 温度平衡,可同时在层析柱夹套内通入恒温水。v(5)加样与洗脱。 打开平衡好的层析柱低端出口 ,使柱内溶液流向与床表面相切时关闭出口。将吸 有0.5ml样品的加样滴灌在床表面上1mm处沿管内 壁轻轻转动加样,加完后,打开底端出口使样品流 至床表面,关闭出口,用少量洗脱液同样小心清洗 管内壁12次,使样品流至床表面,然后加洗脱液 加至距床表面23cm高,接上高位贮液瓶并调好流 速即开始洗脱。注意在加样和洗脱过程中应缓慢加 入液体,防止冲坏床表面,影响分辨率。v(6)收集与测定。 收集时可使用自动部分收集器 或手工操作,每管接洗脱液3ml.直至第二个洗脱峰 降至基线附近。收集后用721E型分光光度计在 451nm波长处以洗脱液为空白,对每管收集液进行 光吸收测定。以收集管数(或洗脱体积)为横坐标 ,吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线。注 市售凝胶如需彻底处理,可在溶胀后再用 0.5mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCL溶液在室温 中浸泡半小时,但注意必须避免在酸或碱中 加热。另外,用过的凝胶柱如需再生,可用 0.1mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCL洗涤以去掉 堵住网孔的杂质,然后用蒸馏水洗至中性备 有。一般使用几次后就需要再生了。思考题(1)说明凝胶层析的原理 答:单个凝胶珠本身象个“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足 够长的柱子中,作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时,比凝胶珠平均孔径小 的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部,这样的小分子不但其运动路程长,而且受到来自凝胶珠内部 的阻力也很大,所以越小的蛋白质,把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长!凝胶中只有很少的孔 径可接受大的蛋白。因此,大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝 胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。 (2)层析柱中的“纹路”,气泡和凹凸不平的床表面对层析效果有何影响 ?(3)连接高位贮液瓶与层析柱之间的U形导管,有防止层析床液体流干 的作用,说明其原理。(4)恒压贮液瓶为何能保证操作压的恒定?
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