第二章 细胞工程的理论基础山东师范大学生命科学学院n动物细胞与组织培养（cell and tissue culture ）是动物细胞工程的重要技术基础。n动物的细胞与组织培养是指从活的机体中 取出组织或细胞，模拟机体内生理条件， 在体外建立无菌、适温和一定营养条件等 ，使之生长和生存，并维持其结构和功能 的技术。n组织培养的概念组织培养这一名词实际上是一个通用名词 ，习惯上泛指所有的体外培养。根据培养 物的不同可概括为三个不同概念：细胞培 养、组织培养和器官培养。A：细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法 分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养 于固体基质上，成单层细胞生长，或在培 养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培 养。B：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有 培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织 块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称 为组织培养。从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在 生长的同时也发生移动，至使组织培养难 以长时间维持其原有结构，结果也就成了 细胞培养。C：器官培养：是指采取某些措施使器官的原 基、器官的一部分或整个器官在体外存活 、生长，并保持其原有结构和功能的培养 技术。体外培养的种类二、 细胞培养的现实意义生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白 细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾病的治疗等三、细胞培养的优点1.研究的对象是活细胞在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分 活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命 活动等。2. 研究条件可以人为控制可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。3. 研究的样本可以达到比较均一性通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。4. 研究内容便于观察、检测和记录采用各种研究技术、记录方法：研究: 倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流 式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原 位杂交、同位素标记-记录: 摄影照片、缩时电影、电视-5.研究的范围比较广泛学科多：细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等对象广：各种动物：低等动物-高等动物-人类一种动物：不同年龄-不同组织-正常或异常（肿瘤-）6.研究的费用相对较经济可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象四、细胞培养的缺点现人工模拟体内环境的技术已经很高, 但, 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同. 当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中,久了，必然发生变化.因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能又具有某些改变的特定的细胞群体，而不能将之与体内的细胞完全等同。五、细胞培养的工作原则u有标准化的工作方法 u培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKS液及 抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配 制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名 称、浓度、消毒与否和制备日期等。 u一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其 中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已 消毒品与未消毒品应分别存放。 第二节 组织培养的细胞生物学一、体内外细胞的差异和分化（一）体内外细胞的差异培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现类似“反祖” 现象；表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。1.与体内主要不同相对孤立、相对单一缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 2.主要表现失去原有组织结构和细胞形态分化减弱或不显细胞趋向单一化； 3.提示要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。（二）培养细胞的分化1不适应(Deadaption)：表现为，细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，如肝细胞产生酪氨酸转移酶(Tyrosine Aminotranserase)特性的丧失.2脱分化或去分化(Dedifferentiation)细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化的能力。二、培养细胞形态分类体外细胞培养物的生长类型 按生长方式:2型粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 贴附(粘附)型细胞 粘附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式含义 两方面结果 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和生长。培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞类型细胞在体内、外的粘附方式：存在差异体内：粘附是全方位外形具有复杂的立体特征体外：多数情况，细胞只有一个附着平面外形一般与体内时明显不同按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类型 分类 根据形态大致的不同，主要2类：上皮细胞型成纤维细胞型其它，不定型上皮细胞型 名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于-来源：来源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核 生长特点易相连成片相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动很少脱离细胞群而单个活动体外培养细胞类型（1）上皮细胞型成纤维细胞型 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出23个长短不等的突起中有卵圆形核生长特点排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片，细胞细胞接触易断开而单独行动游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起体外培养细胞类型（2）成纤维细胞型贴附生长型-类型1. 与体内同名的细胞不完全相同如：形态相似的成纤维细胞，可不同来源自同一动物不同组织的成纤维样细胞相似但发展趋向不同2. 培养细胞的形态不稳定条件改变，细胞形态可有变化 培养细胞形态不稳定血清 Hela 高血清 低血清成纤维细胞样 上皮样细胞pH Hela 太酸或太碱 标准pH成纤维细胞样 上皮样细胞细胞密度 3T3 低密度 高密度成纤维细胞样 上皮样细胞生长状态改变悬浮或贴附 悬浮 贴附圆形 成纤维或上皮样转化与否 未转化 转化后成纤维样 可成上皮样 悬浮生长型概念培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源自血，脾或骨髓， 尤以血中白细胞癌肿细胞也可能特点在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点 生存空间大，提供数量大传代方便(不需消化)易于收获可获得稳定状态缺点观察不方便很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)三、培养细胞的生长特点（一）贴附（二）接触抑制（三）密度抑制四、培养细胞的生长和增殖过程（一）组织培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells)所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。正常培养的细胞周期原代培养(Primary Culture)期也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。传代期特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺 盛，并能维持二倍体核型。传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞 的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是 有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部 分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一 过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系 （Cell Line）。衰退期特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。（二）体外培养细胞一代生存期潜伏期指数增生期停滞期所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。（三）单个细胞的生长过程五、体外培养细胞的遗传学特征（一）核型变化（二）永生化和恶变（三）细胞性别六、体外培养细胞的生存环境（一）无污染环境（二）温度（三）气体环境和氢离子浓度七、体外培养细胞生存所需基本物质（一）糖（二）氨基酸（三）维生素（四）促生长因子（五）其它物质第三节 建立细胞系或细胞株一、体外培养细胞的种类和命名（一）初代培养初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养(5ubculture)的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。（二）细胞系初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之 为细胞系。有限细胞系无限细胞系(三)克隆细胞株从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选购方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。(四)二倍体细胞培养细胞染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同(2n细胞占75或80以上)的细胞群，称二倍体细胞培养。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。(五)肿瘤细胞系或株是现有细胞系中最多的一类，我国已建立细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈上皮细胞型，常已传几十代或百代以上，并并具有不死性和异体接种致瘤性。对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称； 细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩 写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以 便记忆和了解，今列举以下几种代表性的细胞名称供 参考；HeLa：为供体患者的性名(来源于宫颈癌)CHO：中国地鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary)宫743：富颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3；美国国立卫生研究所(National Institute of Health)建立, 每3天传代一次，每次接种3106细胞毫 升。（六）细胞系或细胞株的命名二、建立细胞系（或株）的要求（一）组织来源（二）细胞生物学检测（三）培养条件和方法三、已建立细胞系或株的签定、管理和使用培 养 简 历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、 供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等。 冻 存 液：培养基和防冻液名称。 细 胞 活 力：融解前后细胞接种存活率和生长特性。 培 养 液：培养基种类和名称(一般要求不含抗生素)，血 清来源和含量。 细 胞 形 态：类型，如为上皮或成纤维细胞等。 核 型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无。 无污染测验：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等。 物 种 检 测：检测同功酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染。 免 疫 检 测：一两种血清学检测。 细胞建立 者：建立者性名；检测者姓名。