菌种保存方法菌种保存方法 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物 的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其 不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素， 所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。保藏方法大致可分为以下几种：1传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌 氧细菌用），培养后于 46冰箱内保存。2液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面 培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培 养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱 代谢作用。3载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上， 而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广 泛。4寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克 次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并 传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦 可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。5冷冻保藏法可分低温冰箱（-20-30，-50-80）、干冰酒精快速冻结 （约-70）和液氮（-196）等保藏法。6冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70左右）下快速冷冻，然后在减压 下利用升华现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需 使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞 的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力 来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲 亚砜等。三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液 体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐， 干冰，95酒精，10盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿 管（长颈球形底），40 目与 100 目筛子，油纸，滤纸条 （0512cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L 形五通 管，冰箱，低温冰箱（-30），液氮冷冻保藏器。四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。1斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉 塞部分用油纸包扎好，移至 28的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的 细菌保存 24 个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种 一次。此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单， 使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变 异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性 不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物 的性状；污染杂菌的机会亦较多。2液体石蜡保藏法（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包 扎，105kg/cm2，1213灭菌 30 分钟，然后放在 40温箱中， 使水汽蒸发掉，备用。（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得 到健壮的菌体或孢子。（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上， 其用量以高出斜面顶端 1cm 为准（图-12），使菌种与空气隔绝。（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下 比冰箱中保存的时间还要长）。此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏 2 年以上 不死，酵母菌可保藏 12 年，一般无芽孢细菌也可保藏 1 年左右， 甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在 37温箱内，亦可保藏 3 个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常 移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携 带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培 养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。3滤纸保藏法（1）将滤纸剪成 0512cm 的小条，装入 068cm 的安瓿 管中，每管 12 张，塞以棉塞，105kg/cm2，1213灭菌 30 分钟。（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分 生长。（3）取灭菌脱脂牛乳 12ml 滴加在灭菌培养皿或试管内，取 数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱， 再放回至安瓿管中，塞上棉塞。（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真 空泵抽气至干。（6）将棉花塞入管内，用火焰按图-13 熔封，保存于低温下。（7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热， 滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃， 待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏 2 年 左右，有些丝状真菌甚至可保藏 1417 年之久。此法较液氮、冷冻 干燥法简便，不需要特殊设备。4沙土保藏法（1）取河沙加入 10稀盐酸，加热煮沸 30 分钟，以去除其中 的有机质。（2）倒去酸水，用自来水冲洗至中性。 （3）烘干，用 40 目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。（4）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。（5）烘干，碾碎，通过 100 目筛子过筛，以去除粗颗粒。（6）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入 10100mm 的小试管或安瓿管中，每管装 1g 左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。（7）抽样进行无菌检查，每 10 支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37培养 48 小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。（8）选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。（9）于每支沙土管中加入约 05ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。（10）放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在 12 小时内抽干。（11）每 10 支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。（12）若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。（13）需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存 2 年左右，但应用于营养细胞效果不佳。5液氮冷冻保藏法（1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用 7510mm 的，或能容 12mm 液体的。（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，105kg/cm2，1213灭菌15 分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10的甘油蒸馏水溶液或 10二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用 105kg/cm2，1213灭菌 15 分钟。（3）接入菌种将菌种用 10的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降 1的慢速冻结至-30。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。（5）保藏经冻结至-30的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器（图-14）的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150，液态氮内为-196。（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入3840的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。6冷冻干燥保藏法（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管（图-15），大小要求外径 675mm，长 105mm，球部直径 911mm，壁厚0612mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，105kg/cm2，1213灭菌 30 分钟，备用。（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求 2448 小时的培养物；酵母需培养 3 天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养 710 天。（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳 2ml 左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装 02ml。（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体 CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻 45 分钟，即可使悬液结冰。（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15。装置仪器如图-16，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。抽气一般若在 30 分钟内能达到 933Pa（07mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度 267Pa（02mmHg），保持压力 68 小时即可。（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用 L 形五通管（图-17）继续抽气，约 10 分钟即可达到267Pa（02mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。厌氧菌的培养方法厌氧菌的培养方法 厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一 个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法 去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基 乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多， 可根据实际情况选用。1厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧 缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成 厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。2厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧 菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢 钠固体以及 5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。 放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折 断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无 气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。3厌氧手套箱（Anaerobie glove box）是迄今为止国际上公认 的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型