微生物与环境监测微生物与环境监测Microbiology Department.College of Resource & Environment SWU. Li Yong一、指示微生物一、指示微生物l指示微生物（indicator microorganism） 或称指示菌（indicator bacteria）l是在常规环境监测中，用以指示环境样品 污染性质与程度，并评价环境卫生状况的 具有代表性的微生物。l主要生物性污染：细菌、真菌、病毒等各 类微生物均有。1.1.细菌总数细菌总数l细菌总数（total bacteria count）： 指环境中被测样品，在一定条件下（培 养基成分、培养温度和时间、pH、通气 状况等）培养后所得的1m1或lg检样中所 含的细菌菌落总数。l它反映环境中异养型细菌的污染度，也 间接反映一般营养性有机物的污染程度 。1液态与固态对象中的细菌总数l天然水体、饮水、饮料等液体物l土壤、污泥、堆肥、食品、化妆品、药 品等固态物，l常用倾注平板培养法或平板表面涂布培 养法。国家卫生标准中规定：l营养肉汤琼脂培养基，l将经过一定倍数稀释的样品悬液，定量 接种于琼脂培养基平板，或倾注混匀， 或表面均匀涂布；l在有氧条件下，37培养48h观察平板上 菌落生长结果。2空气中的细菌总数l平板暴露沉降法l仪器法 平板暴露沉降法：l采用直径9cm平皿，将营养琼脂平板在 1.2 m高处暴露5 min，37培养48h，计 数生长菌落数。l测定的结果不是十分准确。l经济方便，有实用价值。l仪器法中以固体撞击式采样器多用。结果：l采用个m1为单位来表示 lcfu（colony forming unit）表示 ：指 单位体积、单位表面积或单位质量检样 中的菌落形成单位。 细菌总数的卫生标准细菌总数的卫生标准对象样品细菌总数/（cfu/ml或g）霉菌数/（cfu/ml或g）饮用水*1100水矿泉水*2水源水5灌装水50体游泳池水*31 000消毒牛乳30 000全脂奶粉特级20 000食*一级30 000二级50 000肉灌肠类出厂20 000销售50 000糕点、面包冷加工出厂5 000100品销售10 000150糕点、面包冷加工出厂1 00050销售1 500500化*5眼部、口唇、口腔黏膜500100妆儿童化妆品500100品其他化妆品1 000100药*6中药片剂10 000500丸 剂50 000500品散剂100 000500我国公共场所空气细菌总数标准*撞击法/（cfu/m3 ）沉降法/（个/皿 ）适用范围1 0001035星级以下宾馆，饭店1 500102星级以下宾馆和非星级带空调宾馆 ，饭 店 2 500300普通饭店，招待所，酒吧，茶座，咖啡厅 ，图书馆 ，博物馆，美术馆，飞机客舱4 00040影剧院，音乐厅，录像厅，医院候诊室， 候机室旅客列车车厢 ，轮船客舱，饭馆（ 餐厅）7 00075展览馆，商场（店），候车室，候船室4 00040游泳馆2.2.霉菌和酵母菌总数霉菌和酵母菌总数l霉菌和酵母菌数（fungi and yeast count）是指环境中被测样品经过处理， 在一定条件下培养后，所得1g或lm1检样 中所含的霉菌和酵母菌菌落数。l霉菌和酵母菌是异养型微生物，能致病 或产毒素。 检测方法l用倾注培养平板法。多采用孟加拉红（ 虎红）培养基、高渗察氏培养基或加有 抗菌素的马铃薯葡萄糖培养基。l环境样本作一定倍数稀释后，定量注入 灭菌平皿。l倾入培养基混匀，凝固后置入2528 温箱培养35天观察平板上菌落生长情 况并计数。结果：l以每毫升或每克检样中菌落形成单位（ cfum1或g）来表示。二、粪便污染指示菌二、粪便污染指示菌 l病原菌一般在环境中存在的数量不大， 而且检测方法较复杂，难以直接测定。l其他微生物作为代表，间接指示肠道病 原菌存在。l粪便污染指示菌。理想条件： （1）是人畜粪便中的正常菌，且数量比粪便 中其他菌为多； （2）受人畜粪便污染的环境中可检出，而未 受污染环境无该菌存在； （3）排出至环境后，该菌存活时间与肠道致 病菌相当或略长； （4）对氯等消毒剂及其他不良因素的抵抗力 略强于肠道致病菌； （5）检出与鉴定方法比较简便迅速。l大肠杆菌较理想 ，109个ml；但鉴定方 法比较复杂 ；l含有大肠杆菌在内的总大肠菌群与粪大 肠菌群。 1.1.总大肠菌群总大肠菌群l总大肠菌群（total co1iform），也称大 肠菌群（coliform group或co1iform）；l它们是一群能在37 ，24 h内发酵乳糖 产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴 性无芽孢杆菌。l形成特殊的菌落特征；l大肠菌群不是分类学上的一个名称，而 是人为定义的名词。 肠杆菌科细菌主要包括4个菌属：l埃希氏菌属（Escherichia）在此菌属中与人类 生活密切相关的仅有一个种，即大肠埃希菌也 称大肠杆菌；l其次有柠檬酸杆菌属或称枸橼酸杆菌属（ Citrobacter）、l克雷伯菌属（Klebsiella）、l肠杆菌属（Enterobacter）。（1 1）测定方法）测定方法 1多管发酵法（multiple-tube fermentation），又称最 大可能数法（most probable number，MPN）主要步骤： 初发酵试验：l加入含有乳糖蛋白陈培养基（液）中，经37 培养 24 h，l观察产酸产气情况以初步判别是否有大肠菌群存在 。 平板分离。l将初发酵试验产酸产气的发酵管分别接种在伊红 美蓝琼脂平板上，置37培养24h，观察菌落形 态。l挑选可疑为大肠菌群细菌的菌落涂片、革兰氏染 色、镜检和进行证实试验。 复发酵试验（证实试验）。l上述可能为大肠菌群的菌落再次接人乳糖蛋白陈 培养液，置37温箱培养24h后观察结果。 观察结果：l复发酵试验中仍有产酸产气者即最后确证为有 大肠菌群存在。l根据初发酵管的数目及试验所用的检样量，利 用数理统计原理或查阅专用统计表，最后算出 每毫升检样中大肠菌群的最可能数目。 2.滤膜法（membrane filtration technique，MFT）l水样l滤膜l抽滤细菌l滤膜培养，l鉴定并计数典型菌落，l计算总大肠菌群数。主要步骤： 水样过滤 培养 观察结果：l通过菌落特征及镜检菌体形态初步确定大肠菌群 细菌；l凡革兰氏阴性无芽孢杆菌再接入含乳糖蛋白陈培 养基中以确证为大肠菌群细菌；l最后根据通过水量及滤膜上长出的肯定为大肠菌 的菌落数换算出每升水中大肠菌群数。结果表达方式 ： 大肠菌群数l又称大肠菌指数，其表示方法有多种，地表水环境 质量标准、生活饮用水卫生标准、游泳池水卫生标 准中以个L表示之；食品卫生标准中用个m1表示 。 大肠菌群值l是指水样可检出1个大肠菌群细菌的最小水样容积， 此值愈大即表示水中大肠菌群数愈少。水 ：l大肠菌群值1 000 m1大肠菌群数土壤 l大肠菌群值l g大肠菌群数样样品总总大肠肠菌群粪粪大肠肠菌群I200个/L地表水*1II2 000个/LIII10 000个/L20 000个/L40 000个/L游泳池水*218个/L饮饮用水0个/100 ml0个/100 ml医院排放污污水*3一级级500个/L二级级1 000个/L三级级5 000个/L瓶装汽水瓶装汽水66个个/ml/ml含乳含乳饮饮饮饮料料4040个个/ml/ml天然天然矿矿矿矿泉水泉水不得不得检检检检出出/ml/ml蜂蜜蜂蜜3030个个/ml/ml白糖白糖3030个个/ml/ml熟肉制品熟肉制品3030个个/ml/ml消毒牛乳消毒牛乳9090个个/ml/ml酸牛乳酸牛乳9090个个/ml/ml全脂乳粉全脂乳粉4040个个/ml/ml方法评价 （1）发酵法：（MPN法）步骤多，耗时长，得到结 果需要72h，不能及时指导实践工作。 （2）滤膜法（MFT法）：操作简单，可现场过滤水 样，避免运送水样的麻烦，且缩短时间。但此法不 适用于混浊度高的水样。 （3）总大肠菌群中细菌并非全部来自粪便，可能由 腐败的植物、土壤等其他环境带来，放可能导致某 些不准确性。 （4）饮水加氯消毒可杀灭大肠菌群而难杀灭肠道病 毒，故大肠菌群不能指示水中病毒。2.2.粪大肠菌群粪大肠菌群 l l粪大肠菌群粪大肠菌群（fecal co1iformfecal co1iform）是能在）是能在44.544.5（4444 4545）发酵乳糖的大肠菌群，亦称耐热性大肠菌群（）发酵乳糖的大肠菌群，亦称耐热性大肠菌群（ thermoto1erant coliformthermoto1erant coliform）。）。l l包括包括4 4个属，埃希氏菌属为主，其他个属，埃希氏菌属为主，其他3 3个属数量较少。个属数量较少。l l多数大肠杆菌的菌种可以在多数大肠杆菌的菌种可以在44444545条件下生长。条件下生长。 l l粪大肠菌群数与粪便中大肠杆菌数直接相关，在粪大肠菌群数与粪便中大肠杆菌数直接相关，在 人粪中粪大肠菌群细菌占总大肠菌群数的人粪中粪大肠菌群细菌占总大肠菌群数的96.496.4 ；l l在外环境中粪大肠菌群不易繁殖，在外环境中粪大肠菌群不易繁殖，l l粪大肠菌群较总大肠菌群作为粪便污染指示菌意粪大肠菌群较总大肠菌群作为粪便污染指示菌意 义更大。义更大。 l l常用的方法也有多管发酵法和滤膜法。常用的方法也有多管发酵法和滤膜法。l l多管发酵法是自总大肠菌群乳糖发酵试验的阳性多管发酵法是自总大肠菌群乳糖发酵试验的阳性 管中取管中取1 1滴转种于滴转种于ECEC培养基，培养基，44.544.5培养。然后观培养。然后观 察结果。察结果。l l用滤膜法检测时采用的培养基有区别，总大肠菌用滤膜法检测时采用的培养基有区别，总大肠菌 群滤膜法采用的固体培养基为品红亚硫酸盐（钠群滤膜法采用的固体培养基为品红亚硫酸盐（钠 ）培养基，粪大肠菌群则采用）培养基，粪大肠菌群则采用FMCFMC培养基。培养基。l水中粪大肠菌群与肠道病原微生物具有相关 性，是粪大肠菌群作为指示菌的重要依据； 水体种水体种类类类类每每100 ml100 ml水水样样样样 粪粪粪粪大大肠肠肠肠菌群菌群 数数水水门门门门氏菌氏菌检检检检出情况出情况检样检样检样检样 件数件数阳性阳性检检检检出出 数目数目百分率百分率/%/% 淡淡 水水1 120020029298 827.627.62012012 0002 0002727191985.285.22 0002 0005454535398.198.1海海 水水1 1707018418412126.56.571712002007474212128.428.42012012 0002 0009191404044.044.02 0002 0007575454560603.3.粪链球菌粪链球菌l l粪链球菌（粪链球菌（Streptococcus faecalisStreptococcus faecalis）是短链）是短链 状的革兰氏阳性球菌。状的革兰氏阳性球菌。l l在人粪便内数量很多，每克成人粪便中约含有在人粪便内数量很多，每克成人粪便中约含有 2102108 8个，仅次于大肠菌群细菌。个，仅次于大肠菌群细菌。l l其为粪便污染指示菌的优点是在水中不会自行其为粪便污染指示菌的优点是在水中不会自行 繁殖，但抵抗力弱于病菌。繁殖，但抵抗力弱于病菌。l l粪链球菌可为水质细菌学评价提供有意义的粪链球菌可为水质细菌学评价提供有意义的补补 充材料充材料。l由于人粪便中粪大肠菌群数多于粪链球菌，动物 粪便中则相反，因此，在水质检测时可根据两菌 菌数比值不同而推测粪便污染的来源。l粪大肠菌群粪链球菌的比值（