石蜡切片的制作石蜡切片的过程v动物的处死v动物组织取材v固定v组织固定后的处理v脱水和透明v包埋v切片一、动物的处死v麻醉v空气栓塞v颈椎脱臼或断头v股动脉放血二、动物组织取材v动物组织取材原则： 尽量保持组织的生活状 态。v动作要快v不要过度用力夹捏组 织，防止组织变形。三、固定v1、目的： 尽量保持组织的生前状态，防止组织的死后 变化、自溶。 保持细胞和组织原有的形态结构， 保持组织内部成分特征不发生变化。v2、方式：浸入式灌注式灌注式v此法适用于动物实验研究。自左心室插入主 动脉，先以生理盐水冲冼血液后，以泵、吊 筒或50-100ml注射器注入固定液。然后取 材，投入固定液。v灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织 。达到充分固定之目的。3、固定液v醛类固定剂 v非醛类固定剂v丙酮及醇类固定剂醛类固定剂v双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交 联。v包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛v通常与其他的试剂联合使用v优点是对组织穿透性强，收缩性小。可以保 存蛋白质、脂肪、黏液物质以及一定量的糖 原。v缺点：长期固定使组织过度硬化及细胞核不 着色，并且产生“福尔马林色素”，它是由于 血红蛋白与甲醛转化的酸形成正铁血红素。非醛类固定剂v氯化汞（HgCI2）：蛋白的强固定剂v重铬酸钾：保存类脂、高尔基复合体、及染色体等结 构。v苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定剂，v醋酸：固定染色体。软化组织，缓解收缩。v蔗糖：防止某些细胞成分扩散，保持酶活性，良好形态 。v四氧化锇：保存细胞蛋白质细微结构有良好效应，应用 与 电镜观察切片的固定与染色。丙酮及醇类固定剂v丙酮：沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强。可 以单独使用，低温下保持酶活性效果好。v乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白质、 多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差。必须与其他 试剂混合使用，单独使用使组织收缩严重，对细 胞形态保存不良。混合固定剂v固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组 织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂 混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂 对组织所致的缺陷。v4%多聚甲醛磷酸缓冲液 pH7.4v成分： 4%多聚甲醛溶于1倍的磷酸缓冲液中 ，v1倍的磷酸缓冲液:PBS MVv NaCl 140mM 58.44 v KCl 2.7mM 74.55v NaH2PO412H2O， 10mM 358.14v KH2PO4 1.8mM 136.09v 调pH至7.4。 Bouins液v苦味酸饱和水溶液 75ml 15 固定糖原v37%-40%福尔马林液 25ml 5 固定蛋白和脂肪v冰醋酸 5ml 1 凝固核染色质固定组织时应注意：v应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定 处理。v组织块不易过大过厚，必须小于 2cm1.5cm0.3cm，尤其是组织块厚度必须控 制在0.3cm以内。v固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组 织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。固定时间的选择v不同的研究目的所需使用的固定液。v材料的大小，组织的特性与致密度。v温度的不同有所差别。组织固定后的处理v冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固 定液造成的人为假象。v修块:大小合适、去除形态不好的部分，四、脱水v脱水目的：运用某种溶剂置换组织内的水 分。v脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等v乙醇：最常用的脱水剂v一般组织：70%-80%-90%-100%- 100%v特殊组织：30%-40-%-50%-60%-70%- 80%-90%-100%- 100% 每步30分钟左右 。v要求：完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间v 不能过度脱水（使组织变脆）v不同组织脱水时间不同：v大的致密的组织需要延长脱水时间v为加速各级酒精的穿透力，脱水可 在37温箱中进行。 五、透明或媒浸目的与作用v对组织的最后脱水处理v与包埋剂置换 透明剂： 苯、甲苯、二甲苯、氯仿等 有机溶剂v100%乙醇脱水后进入二甲 苯两次，保证透明完全。六、包埋包埋剂的特点：v具有一定的强度和韧度，满足切片的要求。v能完全进入组织。v对组织内部成分损伤小。石蜡包埋v石蜡特点：熔点：45-50 软蜡v 55-60 硬蜡 常用v石蜡的处理：新蜡应溶一次，增加密度。并用滤纸过滤去处杂质。加5%10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。反复溶的旧蜡包埋效果更好。v程序：在溶蜡箱中进行55-60，恒温。v浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（1：1）中 两次，在石蜡中两次，每次一个小时左右。v包块：在室温进行七 石蜡切片v载玻片处理：v切片：v展片：背面与玻片。 v烘片：37的温箱内烤干(约需12小时)。 v优点：操作比较简便、容易，可以切出较薄 的切片，并且易于制成连续切片，也容易附 着于载玻片上。v缺点：是不适于较大的标本，材料在经过脱 水、浸蜡的过程中容易收缩。火棉胶切片法v透明剂：乙醚与乙醇等量混合v包埋剂：火棉胶溶于透明剂v包埋：常温进行v凝固：在乙醚中过夜，v 在氯仿中过夜。v在70%乙醇中保存。v优点：可切大的组织v 可切较硬的组织如硬骨v缺点：操作所用时间长v 一般切片厚度为20-30m。v 不能连续切片v 全部试剂为易燃物质，注意防火冰冻切片法 v取材：液氮保存v载玻片处理v切片v保存：-70 或-20