目录目录1 1细胞培养基本概念细胞培养基本概念2 2细胞培养基本要求细胞培养基本要求3 3细胞培养基本技术细胞培养基本技术细胞培养定义u定义：模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程 等问题的研究。u优点： 1活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控； 3研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、 免疫组织化学、原位杂交、同位素标记； 4应用广： 不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；u缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了 ，必然发生变化。 细胞培养的基本概念v 传代：v 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到 新的培养器皿中。v 原代培养v 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在 传代之前称为原代培养。v 接触抑制（Contact inhibition）v细胞相互接触时，将停 止增长；v细胞停留在细胞周期的 G0期；v转化的细胞却可以继续 生长导致细胞重叠堆积 生长。 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一 定的界限，称为“ Hayflick极限”。 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次； 龟寿命200年，传代140次。 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼 年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代 。 细胞传代次数（Passage Number）原代培养 （primary culture） 从动物机体取出的进 行培养的细胞群。生 长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般10代以 内）停止生长。克隆（clone）亦称无 性繁殖系或无性 系。对细胞来说 ，克隆是指由同 一个祖先细胞通 过有丝分裂产生 的遗传性状一致 的细胞群。 细胞系（cell line ）从肿瘤组 织培养建立 的细胞群或 培养过程中 发生突变或 转化的细胞 ，在培养条 件下可无限 繁殖 细胞株（cell strain） 从原代培养细 胞群中筛选出 的具有特定性 质或标志的细 胞群，能够繁 殖50代左右， 在培养过程中 其特征始终保 持。 原代培养与细胞系原代培养细胞的生命归宿v原代培养期v传代期v衰退期 The American Type Culture Collection (ATCC) The European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) National Institute of Health (NIH), USA National Cancer Institute (NCI), USA细胞系资源v有限细胞系，无限细胞系 v细胞系 cell linev细胞株 cell strain 培养细胞的特性v 培养细胞的生长方式v贴附生长：v 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞v悬浮生长：v 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见 于各种造血系统肿瘤细胞每代贴附生长细胞的生长过程v游离期v贴壁期v潜伏期v对数生长期v停止期（平台期）v游离期：v细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此 时细胞质回缩，胞体呈圆球形。v10分钟一4小时v贴壁期：v细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时 贴壁。v底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等v血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（ 生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物 上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。v进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）v潜伏期v此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。v对数生长期：v细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。v停止期（平台期）：v细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂v机制：接触抑制、密度依赖性二、细胞培养基本要求v常用仪器设备v培养器皿v培养基v血清v其他细胞培养试剂培养细胞生长的条件v1 细胞的营养需要v2 细胞的生存环境v 温度: 37 v O2v CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-v pH: 7.2-7.4v 渗透压v 3 无污染v 4 无毒常用仪器设备v超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸vCO2培养箱v倒置显微镜v酶标仪、微孔板震荡器v液氮罐v自动双重纯水蒸馏器，纯水仪v耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管v压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广v电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃v器皿消毒 v滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清 、 v酶液等均采用滤过法除菌 v超净工作台：为细胞操作提供无菌环境v紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料v培养皿和培养板等表面消毒 超净台v n超净工作台的工 作原理是利用鼓风 机驱动空气遁过高 效滤器除去空气中 的尘埃颗粒，使空 气得到净化。净化 空气徐徐通过工作 台面，使工作台内 构成无菌环境。 滤 器CO2培养箱nCO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问 题：n 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖 微松，以保证通气。n 保持培养箱内空气干净。定期消毒n（90 ，14 h)。n箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中 以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器 纯水仪酶标仪 微孔板震荡器Culture flaskCulture flaskCulture PlateCulture Plate 培养器皿v浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时） 、v流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干n常用玻璃器皿清洗清洁液的配制细胞培养基细胞培养基vv干粉培养基和液体培养基干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭干粉培养基需使用者自己配制并灭 菌，其优点是价格便宜。缺点是配菌，其优点是价格便宜。缺点是配 制过程繁琐，质量不易控制制过程繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规液体培养基是由专业厂家按标准规 模化生产，不仅质量得到保证，而模化生产，不仅质量得到保证，而 且使用十分方便且使用十分方便vv常用的培养基种类常用的培养基种类RPMI-1640RPMI-1640（标准型）、（标准型）、DMEM-DMEM-高糖高糖 （标准型）、（标准型）、DMEM-DMEM-低糖（标准型）低糖（标准型） 、McCoys 5AMcCoys 5A、M199M199、F12F12等等培养基的选择没有一定的标准，有几点建议可供参考：1.建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的 培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 2.其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合 多种细胞。 3.用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生 长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 血清使用注意事项1.血清必须贮存于20 -70，若存放于4，请勿超过一个月。如果一次无法用 完一瓶，可将4045 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加 约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2.血清解冻步骤(逐步解冻法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后 再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减 少沉淀的发生。勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白 质凝结而发生沉淀。3.热灭活（heat-inactivation）是指56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。此热处 理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作 此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。4.勿将血清置于37太久，若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较 不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质v凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白 (lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成 ，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉 淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入 培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为 会阻塞过滤膜。 v显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成 会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误 认为血清遭受污染，而将血清放在37中欲培养此“微生物“，但在 37环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但 以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不 会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。 血清沉淀物 如何避免沉淀物的产生?v解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20至4至室温)，若血清解 冻时改变的温度太大(如-20至37)，实验显示非常容易产生沉淀物。v 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发 生。v 请勿将血清置于37太久。若在37放置太久，血清会变得混浊，同时 血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。v 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。v 若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的原则，并且随时摇晃均 匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。谷氨酰胺v谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添 加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置7天 即可分解约50%，所以都是在使用前添加v配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4放置2周以上时，要重新 加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加 入培养液内v使用终浓度为1-4mMv一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mM（29.22g/L）v配制方法为 ：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成 200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30），过滤除菌，分 装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷 氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM 酚红酚红vv大多数培养液中使用酚红作为大多数培养液中使用酚红作为pH pH 指示指示红色表示中性红色表示中性pHpH黄色代表酸性黄色代表酸性pHpH紫色表示碱性紫色表示碱性pHpHvv在一些特殊培养液中不含酚红在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激 素（尤其是雌激素）样作用素（尤其是雌激素）样作用水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4.H2O 1.56 gKH2PO4