分子荧光光谱法郑秀玉分子荧光光谱法又称分子发光光谱法或 荧光分光光度法，即通常所谓的荧光分析法 。该法是一种利用某一波长的光线照射试样 ，使试样吸收这一辐射，然后再发射出波长 相同或波长较长的光线的化学分析方法。定性定量分子吸收了紫外-可见光的辐射后，它的电子能级跃迁至 激发态，然后以热能形式将这一部分能量释放出来，本身 又回复到基态。如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子 以发射辐射的方式释放这一部分能量，再发射的波长可以 同分子所吸收的波长相同，也可以不同。荧光（Fluorescence）：当激发光停止照射后，发光过 程几乎立即停止（10-910-6秒）磷光（Phosphorescence）：将持续一段时间（ 10-3 10秒）一、光致发光（Photoluminescent）二、荧光、磷光产生原理 1、分子的激发态单重激发态和三重激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电 子成对地存在于能量最低的各 个原子或分子轨道中 ，根据Pauli不相容原理，一个给定轨道中的两个电 子，必定具有相反方向的自旋，即自旋量子数分别 为1/2、-1/2，电子总自旋量子数等于零：S=+(- )=0，即基态没有净自旋，其电子能态的多重性 M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，基态的多重性 为1，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁 场影响而分裂，称“单重态”；单重态：单重激发态：当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被 激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋 方向不改变，即两个电子的自旋方向仍相反， 总自旋量子数S=0， M=2S+1=1，则分子处于的激 发态仍是单重态，即“单重激发态”；如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的 改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，即两 个电子的自旋量子数都为1/2，电子总自旋量子数不 等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 ，其多重性： M=2S+1=3，即分子在磁场中受到影响而产生能级 分裂，这种受激态称为“三重激发态”；三重激发态：2、分子去活化过程及荧光的发生 一个分子的外层电子能级包括 S0（基态）和第1至第 n的电子激发的单重激发态S1，S2， Sn ，第1至第 n的电子激发的三重激发态T1 Tn ，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级。分子吸收了紫外-可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单重态的不同振动能级上，根据自旋禁律，不能直接跃迁到激发三重态的各个振动能级上。处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到基态，这个 过程称为“去活化过程”。1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能 量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环 境）回到同一电子激发态的最低振动能 级。 2. 内转换：当激发态S2 的较低振动能级与S1 的较高振动能级的能量相当或重叠时， 分子有可能从S2 的振动能级以无辐射方 式过渡到S1 的能量相等的振动能级上， 这一无辐射过程称为“内转换”。 3.系间跨跃：当电子单重激发态的最低振动能级与电子三重激发态的较高振动能级相 重叠时，发生电子自旋状态改变的 ST 跃迁，这一过程称为 “系间跨跃” 。 4.外转换：激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用而以非辐射形式转移掉能 量回到基态的过程。5. 荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫内转换振动驰豫到达单重激发态的 最低振动能级时，单重激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态 的不同振动能级，此过程称为 “荧光发射”。 6. 磷光发射：三重激发态最低振动能级的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不 同振动能级，此过程称为 “磷光发射”。l由于三重态寿命较长，因而发生振动弛豫及外转换的几率 也高，失去激发能的可能性大，以致在室温条件下很难观 察到溶液中的磷光现象。因此，试样采用液氮冷冻降低其 它去活化才能观察到某些分子的磷光。l处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态，哪 种途径的速度快，哪种途径就优先发生。l如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较快 ，则荧光发生几率高，强度大。l如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较慢 ，则荧光很弱或不发生。三、激发光谱与荧光光谱 1、激发光谱 将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光 波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质 溶液发射的荧光强度(F)，以激发光的波长为横座标，荧 光强度为纵座标作Fl光谱图，便可得到荧光物质的激 发光谱。从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波 长lex，选用 lex可得到强度最大的荧光。2、荧光光谱 如果保持激发光的波长和强度不变，测量不同波长处荧 光的强度分布，将荧光的波长为横座标，荧光强度为纵座标 作F- l 光谱图便得到荧光光谱或称发射光谱。 倍频峰荧光光谱中荧光强度最强的波长为 lem 。四、溶液荧光光谱特征l斯托克斯位移在溶液荧光光谱中，荧光波长总是 大于激发光波长。激发与发射之间存在 着一定的能量损失。l荧光光谱的形状与激发波长无关l荧光光谱与激发光谱呈镜像关系物质分子结构与荧光的发生及荧光强度紧密相关，根 据物质的分子结构可判断物质的荧光特性。 分子能产生荧光或磷光，首先要求分子结构能吸收紫 外和可见辐射。通常，分子吸收辐射的能力愈强，则产生 的荧光或磷光也愈强。荧光体系：几乎都是含有一个或几个苯环的复杂的有机化 合物。在这些化合物中能产生最强荧光的吸收过程通常包含 有 *跃迁而达到电子激发态的。五、荧光与分子结构的关系 六、分析方法 波长扫描 时间扫描 3-D扫描 1、波长扫描 给定发射波长，在激发波长的某一范围内进行扫描。给定激发波长，在发射波长的某一范围内进行扫描 。 EX波长：200-900 nmEM 开始波长：200890nmEM 结束波长：210900nm EM波长：200-890 nmEX 开始波长：200890nmEX 结束波长：210900nm2、时间扫描EX波长：200-900 nmEM波长：200-900 nm 给定激发波长和发射波长，扫描一段时间。3、3-D扫描 EX 开始波长：200850nm EX 结束波长：200900nm EX采样间隔：150nmEM 开始波长：200850nm EM 结束波长：200900nm EM采样间隔：110nm等高线的间隔：0.011000 在激发波长和发射波长的给定范围内进行扫描 。 七、荧光强度与溶液浓度的关系 (一)定量依据If=2.3fI0bc（荧光物质浓度很小）式中：f为荧光效率，I0为激发光的强度，荧光物质的摩尔 吸收系数，b为试样池的光程，c为荧光物质的浓度。在一定条件下，f、I0、b均为常数：If=Kc（二）定量方法1. 标准曲线法配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出未知试样的浓度。2. 比较法在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较：（3）荧光定性分析 将实验测得样品的荧光激发光光谱和荧光发射光谱与标准荧光光谱图进行比较来鉴定样品成分。七、荧光分析法的应用七、荧光分析法的应用目前荧光分析大多用于定量分析，由于自身发射荧光的化合物不多，因此往往利用有机试剂与荧光较弱或不显荧光的物质结合形成发荧光的配合物来进行测定。(1)无机化合物的分析与有机试剂形成配合物后测量；可测量约60多种元素。（2）有机化合物的分析芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发生荧光，可以直接进行荧光测定；而脂肪族化合物的分子结构较简单，本身能发荧光的很少，须与某些试剂反应后才能进行分析。由于分子荧光分析法的选择性和灵敏性由于分子荧光分析法的选择性和灵敏性 好，常应用于医药、食品、生物化学和天好，常应用于医药、食品、生物化学和天 然产物的分析。在有机物分析方面应用较然产物的分析。在有机物分析方面应用较 多。多。应 用：八、磷光分析法及应用与荧光相比，磷光具有两个特点：（1）磷光辐射的波长比荧光长；（2）磷光的寿命比荧光长。1.磷光强度与磷光物质浓度的关系当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质浓度c之间的关系式为：Ip=2.3pI0bc式中：p为磷光效率，I0为激发光的强度，磷光物质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程。在一定条件下，p、I0、b均为常数，所以上式可写成：Ip=Kc2. 温度对磷光强度的影响随着温度的降低，磷光逐渐增强。3. 低温磷光用液氮作冷却剂。九、仪器介绍 F-4500（1）激发光源：通常用汞弧灯、氢弧灯或氙灯。 （2）试样液槽：通常用石英制成。 （3）测量荧光的检测器：要求检测器有较高的灵敏度。一般用光电管或光电倍增管做检 测器。 （4）激发用单色器：其作用是获得单色性较好的激发光以激发样品产生荧光；荧光用单色器：其作用在于减少光谱干扰，得到一定波长的荧光。