肿瘤药理实验方法 初代培养物开始第一次传代培养后的 细胞，即称之为细胞系（Cell Line）。 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单 细胞分离培养或通过筛选的方法，由单 细胞增殖形成的细胞群，称细胞株（ Cell strain）。 细胞株细胞株与细胞系细胞系的概念肿瘤细胞体外实验方法（动物的，人的）动物肿瘤体内实验方法（移植性、诱发性、自发性） 肿瘤转移的动物实验模型肿瘤免疫药理研究方法肿瘤药理学基本的实验方法体内实验In vivo肿瘤药理学实验方法(In Vitro) 肿瘤药理学体内实验方法整体动物实验法是评价一个药物是否有效 的最主要的方法，即使在体外有一个很好的疗 效，最终也一定要在体内进行观察。因此，用 整体动物实验方法来观察药物的作用显得很重 要。 研究药物的体内抗肿瘤作用，就必须建立 各种肿瘤的动物模型，模型越接近于人体其意 义越大。动物肿瘤体内实验方法实 验 动 物 的 选 择移植性动物肿瘤模型诱发性动物肿瘤模型自发性动物肿瘤模型不同种类的动物对致癌物质的敏感 性不同，其癌自发率也不同。常用于自 发、诱发或移植的动物有：小鼠、裸 鼠、金黄地鼠、大鼠 豚鼠、两栖类动物如蛙、鸟类。 其它许多家畜如猪马牛羊犬猫家兔 等都可发生各种肿瘤。动物肿瘤体内实验方法 动 物 的 选 择小 鼠小鼠肿瘤自发率高，其自发性肿瘤无论 是从组织发生、临床过程以及组织形态学上 都与人类的肿瘤接近。所以小鼠目前广泛用 于癌、肉瘤、白血病以及其它恶性肿瘤的研 究。进行抗肿瘤药物筛选，小鼠自发性肿瘤 模型优于移植性肿瘤模型。动物肿瘤体内实验方法 动物的选择裸 鼠裸鼠是一种独特的纯系动物，全身无毛，先天性 无胸腺，T淋巴细胞缺乏，细胞免疫功能缺乏，对异 体移植几乎无免疫排斥反应，可接受异系、异种肿 瘤肿瘤移植等，有“活试管 ”之称。 自 从 1969 年 Rygaard 、Povlesev 二氏将人类肿瘤异种移植于裸鼠首 次获得成功后，它在肿瘤研究中已被广泛利用。目前移植于裸鼠较为成功的人类肿瘤有：结肠癌、 乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病等。动物肿瘤体内实验方法 动物的选择裸小鼠的费用昂贵，饲养时对实验室的条件 要求高，小鼠不易大量繁殖。因而一般不用于药 物的初筛选研究。由于先天性免疫缺乏，因而在 一般情况下也不用于免疫药物的研究。 裸鼠的缺点动物的选择C57BL/6小鼠 小鼠类的一种，黑毛，体型小，性情较温顺，易 于饲养管理，对药物敏感性好，为研究Lewis肺癌所 选小鼠。费用适中，饲养条件不太高，易大量繁殖 ，因而一般可用于药物的体内初筛选研究。（Lewis 肺癌为C57BL/6小鼠来源的肿瘤） 动物的选择大鼠大鼠也广泛用于肿瘤研究。与小鼠相比 ，大鼠的体型较大，供给的组织较多，便 于进行手术等实验操作。大鼠的肝脏对致 癌物质很敏感，可用二乙基亚硝胺，二甲 基偶氮苯（DAB）复制大鼠肝癌动物模 型，还可用甲基苄基亚硝胺诱发大鼠食管 癌动物模型。大鼠的自发性癌变的发生率较低。动物的选择金黄地鼠：金黄地鼠是肿瘤学实验研究中最常用的动 物，她广泛用于研究肿瘤的增殖、致癌、抗癌、肿瘤转 移、康癌药物的筛选等。 豚鼠：曾被认为是很少发生肿瘤的动物，近年发现豚鼠也 可发生自发性肿瘤，例如支气管乳头腺瘤、白血病等。 两栖类动物：蛙类无毛，光滑的皮肤与人类接近，可为皮 肤癌的研究提供实验模型。 鸟类：鸡和其它鸟类对肿瘤病毒的研究具有极高的实用价 值尤其是对于造血系统和间叶组织肿瘤病毒株具有易感 性。 鱼类：鱼类也可发生不少自发肿瘤，它们对化学致癌物十 分敏感，例如用黄曲霉素、二乙基亚硝胺等可诱发鱼类 肝脏肿瘤和肾母细胞瘤。 其它：许多家畜如马牛羊猪犬猫家兔等都可发生各种肿瘤 。动物肿瘤体内实验方法 动物的选择动物肿瘤体内实验方法实 验 动 物 的 选 择移植性动物肿瘤模型自发性动物肿瘤模型诱发性动物肿瘤模型动物肿瘤体内实验方法 移植性动物肿瘤模型人体肿瘤动物体内移植模型的建立实体瘤动物体内移植模型的建立 非实体瘤动物体内移植模型的建立 移 植 性 动 物 肿 瘤 模 型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立用人的肿瘤细胞通过移植的方法移 植到适合的动物宿主体内，建立一个移 植宿主的体内模型，通过该模型对实验 药物进行药理药效学观察。人体肿瘤动物体内移植可观察癌细 胞对药物的敏感性试验，药物对癌细胞 的逆转作用，药物对癌细胞的增殖抑制 作用和诱导癌细胞的凋亡等作用。移 植 性 动 物 肿 瘤 模 型 人体肿瘤动物体内移植模型的建立动物要求肿瘤细胞来源肿瘤细胞冻存与复苏肿瘤细胞体内接种人体肿瘤动物体内移植模型的建立由于人和动物不同种，存在移植排斥反 应，故要用免疫缺陷动物，如裸鼠。裸小鼠是一种独特的纯系动物，全身无 毛，先天性T细胞缺乏，对异种肿瘤移植几 乎无免疫排斥反应，可接受人类肿瘤移植。裸大鼠无胸腺，缺少T细胞，故能成功地 移植异种皮肤和异种肿瘤，包括小鼠肿瘤及 人肿瘤。 动物要求小白鼠 裸鼠人体肿瘤动物体内移植模型的建立人体肿瘤细胞的来源大致可分为两类，一 类是人的癌细胞株，可从细胞库或其他实验 室得到；另一类是源于人体肿瘤组织块的癌 细胞，主要从临床肿瘤患者体内获得。为了 使肿瘤细胞能得到长期使用和保持不同代的 肿瘤组织的本来特性，防止退化或变异，对 肿瘤细胞的冷冻保存是很必要的。一般情况 下，液氮冻存1-2年后，细胞存活率可达80%- 90。 涉及细胞冻存与复苏技术 。肿瘤细胞的来源1.消化洗涤 将对数增殖期的细胞或腹水瘤细胞经消 化脱壁后，用培养液洗涤l次。 2.冻存细胞 配制含有保护剂 (10%15的DMSO ，甘油等)的培养液作为细胞冻存液。以肿瘤细胞在细 胞冻存液中的密度为ll07/ml左右悬浮细胞。将细胞悬 液加入到2ml塑料冻存管内。密封后注明标记。将冻存 管放入4或30低温冰箱内2h后，移入液氮罐内长 期保存。 3.冻存细胞的复苏 将冻存肿瘤细胞的冻存管从液 氮罐内取出，立即置于37-40 温水中，使冻存细胞 在l min内全部融化，1000r/min离心l0min，弃去上清液 ，用新鲜培养液稀释到所需细胞数，再进行培养。慢冻快融原则 人体肿瘤动物体内移植模型的建立 冻存与复苏方法1.体外培养扩增 无菌条件下，将复苏的肿瘤细胞体外培养、扩增 。2.制备细胞悬液 在对数生长期，用 0.05胰蛋白酶和0.02乙 二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）消化12 min，倾出消化液，加入无血清1640液洗涤，离心，计数，用无血 清1640液或无菌生理盐水配成浓度为1107/ ml的细胞悬液。3.接种肿瘤细胞 在无菌环境中，消毒皮肤，用lml注射器抽吸取 0.2ml细胞悬液（约含2106个肿瘤细胞），接种在裸鼠右前肢根部 （腋窝）皮下。约1周左右局部就长出花生米粒大小瘤块 。4.饲养、观察 在无菌环境中饲养、观察，观察瘤块生长情况， 定期测量瘤体的直径，最后剥瘤称重，计算抑制率。接种步骤人体肿瘤动物体内移植模型的建立动物肿瘤体内实验方法 移植性动物肿瘤模型人体肿瘤动物体内移植模型的建立实体瘤动物体内移植模型的建立 非实体瘤动物体内移植模型的建立 移植性动物肿瘤模型 实体瘤动物体内移植模型的建立小块瘤体接种法肿瘤细胞悬液接种法培养细胞动物体内移植法瘤体测量方法 接种方法主要特点 实体瘤动物体内移植模型的 主要特点 1.一群动物同时接种等量同种癌细胞，肿瘤生 长速度比较一致，个体差异较小； 2.接种的成活率高，接近100%； 3.对宿主的影响较相似，易于客观判断疗效； 4.可在同种或同品系动物中连续移植，长期保留，供试验用； 5.试验周期一般较短，试验条件易于控制。实体瘤动物模型主要用来筛选抗肿瘤药物。移植性动物肿瘤模型 实体瘤动物体内移植模型的建立小块瘤体接种法肿瘤细胞悬液接种法培养细胞动物体内移植法瘤体测量方法 接种方法主要特点 小块瘤体接种法从动物剥离取出肿瘤后，剔除非肿瘤组织和坏 死组织，选取生长良好而无变性坏死、呈淡红色 ( 黑色素瘤则呈黑色或黑紫色)、鱼肉状的瘤组织， 切成2mm2mm2mm的小块，在所选宿主动物的腋 下剪开一个小口，用无钩眼科镊子夹取小块，送入 切口内皮。如何保证切成的小块是2mm2mm2mm？为什么接种在腋下，因为腋下部皮肤松弛，能 使肿瘤生长得较大，可延长宿主动物的寿命。实体瘤动物体内移植模型的 接种方法肿瘤细胞悬液接种法 将选取的肿瘤组织放入玻璃匀浆器中， 用无菌生理盐水研磨后，经滤网过滤成单个 的细胞悬液，用台盼蓝染色法计数活细胞数 ，每个接种点皮下注射0.2ml(含1l06- 1l07个细胞)，每只动物可选用一个或多 个接种点，通常接种于腋下部皮下。在无菌条件下操作。实体瘤动物体内移植模型的 接种方法1.研磨方向及转速制备肿瘤细胞悬液时，在人工研磨时必须使 研磨杆向同一方向转动，不可反向交替研磨，防 止磨破肿瘤细胞；如果采用电动研磨，一定要控 制好转速，以免破坏完整的肿瘤细胞。 2.细胞数细胞数多少适中，如果瘤细胞数过多，接种 后瘤体生长过快，不便于药物作用的观察；瘤细 胞数过少，会导致接种失败，接种部位不能形成 肿瘤。接种失败后再在原动物体内重新接种也难 成功，必须重新更换动物。（为什么？）肿瘤细胞悬液接种注意事项 将培养至快要融合的单层细胞(对数生长期) 用0.25%的胰蛋白酶消化脱壁以后，经用PBS或生 理盐水以1000r/min经l0min离心洗涤2次后，洗 掉细胞中胰蛋白酶和培养液中血清等成分，用台 盼篮染色法计数活细胞数，用生理盐水将肿瘤细 胞稀释成1l06-1l07/ml，每个接种点皮下注 射0.2ml细胞。细胞悬液可置于冰上细胞悬液可置于冰上。培养细胞动物体内移植法实体瘤动物体内移植模型的 接种方法移植性动物肿瘤模型 实体瘤动物体内移植模型的建立小块瘤体接种法肿瘤细胞悬液接种法培养细胞动物体内移植法瘤体测量方法 接种方法主要特点 实体瘤动物体内移植模型实体瘤瘤体测量方法 测量实体瘤生长的方法有 多种，主要包括测定肿瘤的 质量、体积或直径等。瘤体测量方法 通常于停药之后次日处死动物，立即剥离取出 瘤块，剔除其他组织后称重。若对照组小鼠肿瘤 平均小于1g或20%小鼠的瘤重小于400mg，表示肿 瘤生长不良。在治疗期间给药组小鼠死亡率大于 20%或平均体重下降 (自身对照)超过15%者，表示 药物毒性反应，应适当减量重复试验。比较试验组与对照组瘤重的差异，按下列公式 计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率 100% 称量肿瘤的质量 当中药组的瘤重抑制率大于30%，需重复试 验，连续数次疗效稳定，并经统计学处理有显 著性差异时，则评定此药有一定疗效。瘤体的直径与肿瘤的大小及质量成正比。测 量瘤体的直径不需要处死动物，可用来动态观 察瘤体的变化。方法：用游标千分卡尺测量肿瘤的相互垂直 的直径，取它们的平均值即为平均直径。MD100%MD为肿瘤平均直径；A、B、C为实体肿瘤3 个相互垂直的直径，一般用毫米为单位。由于测 量的厚度包括皮肤在内，故瘤体越小，产生的误 差也就越大。注意由同一实验者测量。瘤体测量方法 测量肿瘤的直径 动物肿瘤体内实验方法 移植性动物肿瘤模型人体肿瘤动物体内移植模型的建立实体瘤动物体内移植模型的建立 非实体瘤动物体内移植模型的建立 非实体瘤动物模型的建立 小鼠：67周龄，体重1822g，组间平均体重相差 不宜超过1g，健康，纯种、杂种或杂交第一代，同一 种性别，一般用雌性动物接种。 接种方法：取出小鼠接种第57d的腹水，用生理盐 水将细胞浓度稀释为1l06-1l07/ml，每只小鼠腹 腔注射0.2ml细胞悬液即可。 腹水瘤传代：腹水瘤的传代方法与移植接种方法一 样，需注意的是动物的年龄与体重对腹水会产生影响 ，也是导致数据离散