第二章：菌种的来源q 微生物的特性及工业微生物的要求q 一些工业化产品生产菌种的特点q 自然界中有目的微生物分离的原则q 菌种选育、分子育种第一节 微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性q 有些微生物能在厌氧的条件下生长q 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长q 有些微生物能进行复杂的代谢q 有些微生物能利用较复杂的化合物q 有些微生物能在极端的环境下生长二：工业化菌种的要求q 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物q 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强q 遗传性能要相对稳定q 不易感染它种微生物或噬菌体q 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）q 生产特性要符合工艺要求放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等） 真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：第二节 已工业化产品生产菌的介绍二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用 。50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是 发酵工业发展历史上的一个转折点：HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成 调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌三、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于 食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的 仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌三、常用的基因表达系统(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌沙门氏菌q 生长迅速、蛋白产量高 ;q 表达蛋白的纯化、分离及分析快速；q 外源基因的导入相对容易；q 已建立了整套表达理论及技术.(二) 真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞)q 生长迅速，营养要求不高，易培养 ；q 安全性好；q 比哺乳动物细胞操作简单；q 具有一定的修饰蛋白的能力。 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统q 具有准确的转录后修饰功能；q 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；q 具有重组基因的高效扩增和表达能力；q 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；q CHO很少分泌自身的内源蛋白。微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：第三节 自然界中有目的微生物分离的原则一、菌种分离的一般过程土样的采取 预处理 培养 菌落的选择 产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物问题：二、采样时要注意的问题q 气候、水分、空气q 来源要广q 结合产品的特点q 标签：地点、时间、气候等 富集的三种方案：q 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法 富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。q 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑，q 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等，表2-2 （P31）但主要是通过培养的方法定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速 度的手段，培养（固体、液体；分批 连续）后使目的微生物在种群中占优 势。四、菌落的选出q 从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）q 从形态的角度菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖 产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别。实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）80度30分钟处理文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养34天，选择有凹陷圈的菌落从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型例：醛肟水解酶的筛选-Journal of biotechnology 94(2002), 65-72培养基中含0.05% of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落五、目的微生物富集方法的研究进展q 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等q 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。2002,陈文新（科学院院士）q In contrast to this traditional approach, modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening, which also enables access to enzymes of nonculturable organisms. By this strategy, for instance, the company Diversa (San Diego, CA, USA) identised 120 unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtained from an alkaline soil sample. FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 7381第四节 菌株选育、分子改造目的q 提高生产能力q 提高产品质量q 开发新产品q 解决生产实际问题q 防止菌种退化方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法 DNA Shuffling等自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰 退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。一、自然选育自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落(注意形态的观察)发酵试验二、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选， 称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂的选择出发菌株的选择（一）、诱变剂的作用原理（略）压硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH（三）、诱变育种的一般步骤 (p83)（四）、筛选的方法q 随机筛选q 形态q 理性化筛选从产物形成的生理生化途径着手，进 行有的放矢的筛选。如结构类似物抗 性、营养缺陷型等，筛选而产生的这 些特性，称为遗传标记。结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物 ）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物 ）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV营养缺陷型：如Thr缺陷型黄色短杆菌F9-50的诱变谱系Bervibacterium flavumAs 1.495 (leu-) lys.HCl 2.1 g/lF6-16 (leu -, Thr -) 20.8 g/lF9-50 (leu -, Thr -, AEC r) 33.5 g/l三、基因的直接进化(directed evolution)q 突变基因突变库的建立q 筛选 基因突变库的筛选q 基因复制与遗传步骤：在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过 高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。主要应用：酶学性能的提高:q pHq 温度q 有机溶剂生理环境工业催化环境q 底物专一性脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光学拆分选择性(%)2 31 57 75 81 905次错位PCR 2次定点突变 Reetz (1997) Liebeton(2000) 第二章 菌种的来源定点突变错位PCRDNA Shuffling:指DNA分子的体外重组，是基因在 分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination) 。X XXXX XX XXX XXXX XXX XX XXXXX XX XX XXXX XX XXXXX XX XX XXXX XXX X XX XXX XXX X X X X X XX XFragment Reassemble Select best with DNAseI fragments recombinantsRepeat for multiple cyclesDNA shuffling项目进化速度进化对象进化 周期影响对象突变效率常规定 向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组低DNA Shuffling快速进化特定基因/ 操纵子/病毒几天部分基因组高DNA Shuffling与常规定向进化的比较类 型示 例特 性活性增加倍数潜在应用领域抗 体 人源抗体亲和性400生物制药 酶天冬氨酸转氨酶催化特异性10，000生物制药 -内酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草杆菌蛋白酶E耐热性 65耐热时间17 200工业酶细胞 因子人类干扰素抗病毒285，000基因治疗 肿瘤抑制因子P53 37半衰期12基因治疗 代谢 途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒40生物制药汞代谢途径汞解毒12生物制药部分DNA Shuffling技术的研究成果本章小节：q 涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物(动、植物)才具有大量表达的潜力 ；q 传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；q 目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；q 基因重组、直接进化技术的应用，大大加快了生物产品开发的进程。