Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 实时荧光定量PCR原理及应用上海吉泰生物科技有限公司裴杰萍裴杰萍Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 内 容 提 纲 荧光定量PCR原理及应用 Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 常规核酸定量方法 Southern 杂交 Northern 杂交 原位杂交 传统 RT-PCR 半定量 PCR存在的问题 3灵敏度 3准确性 3特异性 3时间Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 实时荧光定量PCR 定义 利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控 目的 对起始模板进行定量 优点 灵敏, 重复性, 动态范围宽, 高通量l原理C(t)值与起始模板浓度的对数成反比Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 什么是C(t)值C(t)Threshold（域值）Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn C(t)值与起始模板的关系Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 为什么要引入C(t)值CtEndpoints96 replicates of B7 gene molecular beaconGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 1 221利用电泳定量11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold differenceGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 实时荧光定量Ct 18 and Ct 22, 2(4 Ct shift) = 16 fold differenceGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 如何定量标 准 曲 线 未 知 样 品 的 C(t) 值 定量Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 常用的荧光试剂 SYBR Green ITM TaqMan / TaqMan-MGB Molecular Beacons MGB EclipseTM Probes Lux primers ScorpionsTM Amplifluor Q-Zyme Others.dsDNA DetectionTarget-specific DetectionGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn ssDNA = free dye (weak fluorophore)dsDNA = Binds minor groove (intense fluorophore)SYBR Green I (双链DNA结合染料)Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn SYBR Green I DetectionGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn TaqMan 探针未结合的探针探针、引物与目的片段结合，FRET光发射或者以热量形式散失Donor dye (Reporter)Acceptor dye (Quencher)LightEnergy transferTaqTaq 水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离TaqLight EmissionLightGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn HCV (FAM) RNA virus 65bp ampliconHIV-1 (HEX) RNA Virus 74bp amplicon HBV (CY5) DNA virus 81bp ampliconTaqman 三通道实验Daniel Candotti - Cambridge, UKGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 荧光定量PCR应用 特异核酸（基因）定性、定量 RNA (cDNA) 基因表达差异分析 基因芯片结果验证 DNA 病原体定性与定量 GMO (遗传改良组织)检测 序列特异性 等位基因分型, SNP 检测Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 应用之一：病原体检测与定量绝对定量（特异基因的拷贝数病原体的多少）标准品（如质粒）：梯度稀释未知样品阴性对照（NTC）Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 应用之一：病原体检测与定量1 14 43 32 2Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 应用之一：病原体检测与定量Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 应用之二：基因表达差异分析相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的 倍数两种样品：Calibrator（对照，如正常组织） 与Sample（待测样品）两个基因：目的基因与看家基因Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn Normalizer看家基因应用之二：基因表达差异分析CalibratorSampleGene of Interest目的基因CtCtCtCt Ct1 Ct2Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 应用之二：基因表达差异分析基因表达差异2 /2 Ct1 Ct22 2 Ct1 - Ct2X Xn nX X0 0(1+E)(1+E)n nGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 应用之二：基因表达差异分析RNA抽提RT定量PCRcDNA产物系列稀释两个基因的扩增效率Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 应用之二：基因表达差异分析Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 4 fold down3 fold up应用之二：基因表达差异分析Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 两条探针分别针对不同等位基因A AC CGGT TA AC CGGT T应用之三：SNP分析Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 应用之三：SNP分析FAMTETFAMTETGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 应用之三：SNP分析Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 应用之四：GMO检测目的：检测食品等中转基因成分的含量大量的作物被遗传改良来获得一些性状，如：抗除草剂，抗虫，抗病等Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 应用之四：GMO检测 抗除草剂的转基因大豆广泛使用的除草剂的作用成分是草甘膦。草甘膦是EPSPS（5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶 ）的竞争抑制物。在草甘膦存在的条件下，EPSPS的 活性被抑制。植物被转化了一种耐受草甘膦的EPSPS基因，获得 抗性。 Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 检测策略 抗性EPSPS基因的量 转基因大豆的量Lectin基因的量 食品中大豆总量应用之四：GMO检测数据处理：数据处理：C C（t t）EPSPS- -C C（t t）LectinC C（t t）%GMO %GMO（1+E1+E） CtGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 荧光定量PCR仪的硬件条件激发光源热循环加热、制冷样品检测设备Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 荧光定量PCR仪应满足的要求 光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染 料 能分开不同荧光素的激发光与发射光波长 能检测的灵敏度与动态检测范围 准确的温度控制和良好的孔间温度均一性.Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 荧光定量PCR原理及应用 Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn Stratagenes New Mx3000P!High Performance Personal PriceGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn Stratagene 公司成立于1984年,致力于 发展生命科学领域的创新产品与科技. 总部位于美国 La Jolla, California .在欧 洲与日本设有分公司.Stratagene 公司简介Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn Mx3000P 整体设计热盖热循环系统石英卤钨灯发射光滤镜轮激发光滤镜轮光纤扫描臂Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn Mx3000P 热循环系统 96 孔样品槽 半导体加热制冷 温度均一性: +/- 0.25C 升降温速率: up to 2.5C/secGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn 热循环系统 半导体加热制冷 resistive and convective heat exchange 独特的温度补偿条，整板温度均 一性 +/- 0.25C 热盖 反应体积10-100ulGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn Mx3000P 光路系统PMT96 well plate石英卤钨灯激发光滤镜轮发射光滤镜轮扫描式检测同轴光纤Genetimes Technology吉泰生物科技有限公司www.Genetimes.com.cn Mx3000P 光学系统 石英卤钨灯(350-750nm) 2 个滤镜轮