临床PCR检验标本的处理、 保存及核酸提取方法卫生部临床检验中心 李金明临床标本的正确采集、运送、保存 的重要性l临床检验的质量保证关键性环节l解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法 之一核酸提取的重要性l核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分，亦 是手式操作的主要部分l核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与 否l临床PCR检验操作中最易出问题的环节标本采集l标本采集时间对扩增检测结果的影响 l标本采集部位的准备 l标本的类型和采集量 l采样质量的评价 l采样及运输容器 l标本采集中的防污染 标本运送 l样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验 室。l样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测 定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的 EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。l实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床 样本的运送条件作出相应的规定。临床标本的处理和保存l血清（浆）l全血l外周血单个核细胞l痰l棉拭子l脓液l体液l乳汁l组织血清（浆）lDNA测定，可按照一般的血清标本处理程序， 对测定影响不大。lRNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果 ，可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝( 严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制，且很 难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗 凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（12 周）保存可在-20下，较长期保存应在-70 下。 全血l以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选 择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝 素。l全血样本如用于DNA提取检测,可4下短期保 存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提 取RNA 。外周血单个核细胞 l外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有 两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备 ；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细 胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞 。l外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于- 70下.痰l痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定标本 。l痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时,需 对样本进行初步处理，即用1 mol/L NaOH或变性剂液 化。l如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本 只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大 块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用 于核酸提取。 l液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70下。痰标本处理的基本模式l通用模式l简单模式痰标本处理通用模式l试剂：（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP）溶液：由4-6 mol/L盐酸胍（ GuHCl），50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 25 mmol/L EDTA, 0.5%Sarkosyl和0.10.2 mol/L - 巯基乙醇。（2）0.05%Tween 80。（3） 10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20)痰标本处理简单模式 l试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH 、50g蛋白酶K和0.05% Triton X-100痰标本处理中要注意的问题l痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情况 下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN）方法 提取。采用这种方法提取，有可能会在提取 过程中，出现一种可修饰DNA的酶，在最后 一步提取中，与核酸一起洗提出来，从而抑 制其后的扩增。l在PCR主反应混合液中，加入-酪蛋白（ alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类抑制 物产生的效果。 棉拭子l在使用PCR方法检测性病病原体时,临床 标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量 生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置5 10分钟,待大块状物下沉后,取上清立即 离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。l如不立即用于核酸提取,则需保存于-70 下.脓液l脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如 结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采 用痰标本的处理模式，先进行液化，再离心 取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心, 沉淀用生理盐水洗23次后,即可用于DNA 提取。l对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于 粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置, 取上清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水 样,则按上述直接离心取沉淀即可。l沉淀标本的保存条件同样为-70。体液l临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊 液,尿液等,可按水样标本的方式离 心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本的 保存同上。乳汁l 乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA 、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏菌等的 PCR检测。 乳汁中布鲁菌DNA的提取l试剂准备 NET缓冲液: 50mmol/L NaCl, 125mmol/L EDTA, 50mmol/L Tris-HCl pH7.6; 24%十二烷基硫酸钠（SDS）; 蛋白酶K; RNase。 乳汁中分枝杆菌DNA的提取l试剂准备 裂解液：50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异 硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 玻璃珠：（直径：425-600um）组织 l组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处 理步聚首先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切 碎，加入生理盐水后剧烈震荡混匀,离心，弃上清 ，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鲜组织最好 是保存于50%乙醇中,具体作法是，先用生理盐水 将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量 的生理盐水,然后,边摇边加入无水乙醇至终浓度为 50%.这样固定的组织标本室温下可保存数日,4 可保存6年。l石蜡切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脱蜡, 再用蛋白酶K消化后即可进行DNA提取。临床标本的滤纸上保存l临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核酸为 DNA，可室温保存数月至数年，如靶核酸为RNA ，则可稳定数周。 l保存在滤纸上的标本，保存时间长，还可因为标 本中的PCR抑制物如血红蛋白、酶、免疫球蛋白 等吸附于滤纸上，而不对后面的扩增检测造成影 响。 l不管是全血、血清（浆）。还是尿液、粪便、分 泌物等均可此种方法。 临床标本中PCR反应抑制物l内源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其 代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、 脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。l外源性的 :如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维 素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、 标本容器或采样器材上含有的抑制物。 肝素的作用机理 l肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强的抑 制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过 程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上，尽管 肝素和核酸本身都带正电荷。l对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、 反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用。l每g核酸标本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制酶 活性。l在标本中加入肝素酶I 或13 U/g核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 2小时) 可去除 肝素的抑制作用。血红蛋白、乳铁蛋白（lactoferrin）l血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内的主要 PCR抑制物,它们均含有铁。l抑制机制可能是：（1）与这些蛋白释放铁离子至 PCR混合物中有关。研究铁的抑制效应时，发现其干 扰DNA合成，而且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（ Hemin）等血红蛋白衍生物，也是PCR抑制物。（2） 亚铁血红素(Heme)可通过返馈抑制调节DNA聚合酶活 性及协调红细胞内血红蛋白成分的合成。也观察到， 氯化高铁血红素通过直接作用于DNA聚合酶，与成为 一个与靶DNA竞争的抑制剂和核苷酸的非竞争性抑制 剂 。（3）由于靶核酸DNA被血液中大量的凝血有机 物质包裹所致，使得靶DNA不能接触DNA聚合酶。血红蛋白l1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性，与Mg2+ 浓度无关。Tth聚合酶在含4%（V/V）血液的 PCR反应混合液中可以进行扩增，加入1U单链 DNA结合蛋白T4基因32蛋白(gp32)，Tth 聚合酶在含8%（V/V）血液情况下，仍可扩增 。因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可实现 从临床标本不提取纯化核酸直接扩增靶DNA。l不同的热稳定的DNA聚合酶对临床标本中的抑 制物的敏感性不一样 。IgG lIgG的抑制作用是由于其与单链DNA的 相互作用，使得靶DNA不能与DNA聚 合酶相互作用 l使用煮沸作为标本处理方法或使用 PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反应 的抑制 去除或减轻抑制的一些方法lNaOH处理可中和临床标本中的Taq DNA聚合酶抑制剂，但这种方法不 适用于DNA含量低的标本，因为 NaOH处理可使DNA大量丢失。去除或减轻抑制的一些方法l加入0.6% (wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降 低血液对Taq DNA聚合酶的抑制效应，既使在 2%（vol/vol）血液存在下亦可成功扩增，而 通常血液含量只能是0.2%。lBSA也可增加rTth或Taq DNA聚合酶的扩增能 力，使其对粪便和肉类标本中抑制物的抵抗能 力分别提高10和20倍。l单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类似 BSA的增强效应。核酸纯化l核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年代， 在七十年代和八十年代中传统的核酸沉淀溶解 分离纯化方法得到了普遍的应用和推广。l传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、蛋白 酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。 一般核酸提取试剂促使靶核酸从细 胞内释出的原理l靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆 内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微 生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌 细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在 于细胞外。 l一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用 一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的 蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。核酸的分离纯化 l核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等 干扰核酸扩增的物质去除。 l经典方法l硅吸附法l对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室 在使用前，必须对其核酸提取纯度和效 率进行评价。 DNA提取的经典方法l即所谓的” 酚-氯仿提 取法” RNA提取的独特性l临床标本及实验室环境中,存在大量对 RNA具有强烈降解作用的RNase，而 RNase较耐高温,不易失活。l如何避免RNase对标本的污染及防止 RNase对提取的RNA的降解,是保证RNA 成功提取的关键之所在。 RNA提取所用器皿的处理l经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管,离心管等 基本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存 RNA. l实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必 须于180干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯 (DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其 它用品。lDEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于 37下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于 100干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处 理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基 化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。RNA提取所用溶液的准备 l对于RNA提取所需溶液的配制,必须用高压灭菌的水 和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药 匙称取试剂,将溶液装入无RNase的玻璃器皿。可能的 话,溶液均应用0.1%DEPC于37至少处理12小时,然后 于100加热15分钟或高压蒸汽灭菌15分钟。l须注意的是,DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因此不 能用来处理含有Tris一类的缓冲液,因此可存几瓶新的