流式细胞术的特点 及其在CD4细胞检 测中的应用BDB HIV陈放 2014学习目标 流式细胞仪原理（掌握） CD4细胞相关免疫知识（掌握） 检测结果存储，解读（掌握） 手动圈门（了解）内容安排 BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A内容安排 BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A认识流式细胞仪BD公司 BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在纽约创立的,位居财富周刊500强 1973年BD推出世界第一台流式细胞仪 FACS I（ Fluorescence Activated Cell Sorter） 市场占有率：全球75%，中国70%, 中国CDC95以上认识流式细胞仪BD公司BD公司流式细胞仪分为二大类：一类为临床型（Clinic），其特点为仪器的光路 调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学 易掌握。BD公司的临床型FCM FACSCan也是最 早获得美国FDA批准可用于临床诊断的仪器。另一类为科研型（Research）,其特点为可快速 将所感兴趣的细胞分选出来，并且可将单个或指 定个数的细胞分选到特定的培养孔或板上，并且 可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛 的科学研究应用。认识流式细胞仪BD公司CD4检测领域-完善强大的产品线To be LaunchedCD4检测-设立全球范围的检测标准CD4检测BD在中国BDCD4检测的黄金标准！内容安排 BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A人体免疫人体的两道防线固有性免疫（非特异性免疫）皮肤，粘膜，巨噬细胞，NK细胞获得性免疫（特异性免疫）T细胞，B细胞人体免疫获得性免疫细胞免疫T淋巴细胞辅助性T细胞，杀伤性T细胞体液免疫B淋巴细胞HematopoeticHematopoetic Stem CellStem CellLymphocytesLymphocytesGranulocytesGranulocytesMonocytesMonocytes (Macrophages)(Macrophages)ErythrocytesErythrocytesPlateletsPlateletsT TB BN N K KT T HelperHelperT TCytotoxicCytotoxicEosinophilsEosinophilsBasophilsBasophils (Mast Cells)(Mast Cells)NeutrophilsNeutrophils血细胞分化及生长CD分子-白细胞分化抗原白细胞在分化成熟过程中 ，不同的发育阶段和不同 亚类的白细胞出现或消失 的表面标记，这是区分白 细胞的重要标志。1986年 世界卫生组织命名委员会 建议应用CD系列来统一命 名白细胞分化抗原淋巴细胞的免疫表型CD19淋巴细胞的免疫分型 淋巴细胞为CD45强阳性、颗粒度较低的一群细胞 淋巴细胞 T淋巴细胞：CD3+，反映细胞免疫功能 T辅助细胞：CD3+CD4+ T抑制/细胞毒：CD3+CD8+； B淋巴细胞，CD19+，与体液免疫功能有关； NK细胞： CD16+56+/CD3- ，执行免疫监视功能CD4细胞检测原理 CD4细胞是HIV病毒的主要攻击对象CD4细胞检测原理 CD4细胞数量与病程紧密相关内容安排 BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A认识流式细胞仪 定义：在流动流动的状态中检测单个细胞单个细胞的多项理化及功能性指标的一种细胞分析技术细胞分析技术 特点：特异、灵敏、多元化、高速、客观、省时什么是流式细胞术？流式细胞仪就是测量染色细胞标记物荧光强度的分析仪流式细胞术提供的信息：- 相对细胞大小- 相对细胞颗粒密度和内部复杂度- 染色细胞的相对荧光强度认识流式细胞仪认识流式细胞仪FACSCountFACSCount是专 门用于测试艾滋 病人CD4细胞相 关信息的台式仪 器认识流式细胞仪FACSCalibur经典的流式细胞仪双激光 (488nm,635nm)六参数自动进样装机（可选 ）BD FACSCalibur的组成 液流系统引导和聚焦细胞以供检测 光学系统发射和收集光信号 电子系统将光信号转化为电子信号，数字化，传到计算机认识流式细胞仪液流系统鞘液样本流压力系统流动室液流系统：鞘液桶和上样针光学系统 激发系统包括: 激光器 一系列用以聚焦引导光路的棱镜 光学收集系统包括: 一系列的光收集镜用以收集光信号 一系列的反射镜和透镜用以将一定范围波长的光信 号引导到相应的收集系统光学系统两种信号，6个参数FL1 FL2 FL3 FL4FSC SSC散射光信号荧光信号光学系统 FSC（前向角散射光） 代表细胞大小 SSC（侧向角散射光） 代表细胞粒度SSCFSCIncident Light Source人外周全血经过红细胞裂解后光学系统携带有不同荧光染料的细胞通过激光激发，产生 不同的荧光信号什么是荧光素荧光素吸收激光器发出光的能量荧光素放出吸收的能量： 振动能和热能. 释放出更长波长的光 = 488 nm发射光波长抗体照射光波长荧光分子 520 nmH OCO2 HOC细胞检测原理荧光素FITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFITC发射光强度与抗原表达之间的关系FITCFluorescent IntensityNumber of Events荧光素CD3,CD19双荧光染色CD19单阳性细胞CD3单阳性细胞将光学信号转换成电子信号ParameterSSC FL1 FL2 FL3Voltage InPMTPMT Power SupplyPower SupplyLevels 150999 VoltsPhoton InSignal OutLOGTimeFL3TimeFL2TimeFL1TimeSSCVoltage PulsesLINLINLOGLOG电子系统认识流式细胞仪总结FL2TimeTimeTimeTimeFSCFL1SSCTimeFL3FL1Data Proce ssorSSCFSCFL2内容安排 BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A淋巴细胞的免疫表型CD19T淋巴细胞的免疫表型 T淋巴细胞分类复杂，不同类型免疫表型的T淋 巴细胞的功能不同 根据CD4、CD8的表达，T淋巴细胞可分为 T helper/T inducer（CD3+CD4+） T suppressor/ T cytotoxic（CD3+CD8+）如何用流式细胞仪检测相应的特定细胞？第一步：确定待测细胞的特征CD#特异性 CD45白细胞 CD3T淋巴细胞 CD4T辅助细胞 CD8 T抑制细胞 CD19 B细胞 CD16,56 NK细胞检测平台BD FACSCountFACSCount是专 门用于测试艾滋 病人CD4细胞相 关信息的台式仪 器单激光，双色双色预配试剂CD4/CD3 CD8/CD3检测试剂BD FACSCount检测平台BD FACSCalibur经典的流式细胞仪双激光 (488nm,635nm)四色六通道自动进样装置机（可 选）检测平台BD FACSCalibur单激光(488nm)三色五通道机（可选）检测试剂BD FACSCalibur试剂+绝对计数管三色试剂 CD4/CD8/CD3 CD3/CD4/CD45四色试剂 CD3/CD8/CD45/CD4细胞检测原理试剂的选择试剂CD4/CD8/CD3CD3/CD4/CD45CD3/CD8/CD45/ CD4用途成人儿童（5ys）皆可淋巴细胞T淋巴细胞CD4细胞CD8细胞优势CD4/CD8细胞 数比值精确CD4/CD45比值 ，陈旧血样（ 72h）只能用于双激 光四色仪器特异性抗体特异性抗体特定抗原特定抗原抗原抗原第二步：确定钓鱼的鱼饵（抗体）单克隆抗体单克隆抗体第三步：使得结合抗体的细胞得以检测将荧光素标记在抗体上T T T TT TC CH HCD3CD3CD3CD3CD3CD3CD8CD8CD4CD4标记上不同荧光单克隆 抗体的T细胞亚群双荧光染色散点图分析CD8 PECD4 FITC010102103104105010102103104105CD4细胞检测流式检测流程回顾内容安排 BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A用FACSCalibur检测外周血中的CD4细胞 移液器的校准，正确的加样方法 试剂的选择：CD4/CD8/CD3，CD3/CD8/CD45/CD4 完成溶血后免洗的实验步骤 使用MultiSet自动化软件上机 绝对计数管的使用加样注意事项 反向加样法 枪头不能接触到其他液体或微球 充分混匀TruCOUNT管绝对计数原理 TruCOUNT管中预先加有准确定量的Beads，每批 TruCOUNT管的Beads含量一致 样本与beads充分混合，同时检测； 通过如下公式计算各细胞亚群绝对值：细胞获取数 Beads总量细胞/L= Beads获取数 样本量 使用免洗技术，溶血后直接上机检测标本 操作简便，绝对计数结果的重复性好TruCOUNT管绝对计数原理举例：微球： 100个样本量： 50ul获取细胞: 200个获取微球： 50个每ul血液含有细胞数目 = ？内容安排 BD公司介绍 免疫学基础 流式细胞仪原理 流式细胞仪在CD4检测中的应用 绝对计数管在CD4检测中的应用 MultiSET软件和手动圈门 Q&A用FACSCalibur检测外周血中的CD4细胞 上机三部曲：q使用绝对计数管制备样品q用MultiSet软件获取样品手动分析结果（可选）q读取分析结果第一步：实验样本制备64两个15分钟65调用BD FACSComp生成的Lyse/No-Wash实验条 件Calib File.LNW运行质控 调用条件运行软件关闭软件分析数据优化设置获取数据第二步：MultiSET 软件的使用66Place populations on scale in SSC (if needed).Adjust FL3 threshold to get rid of most of the debris.Save optimized settings.Trucount beadslymphocytes运行质控 调用条件运行软件关闭软件分析数据优化设置获取数据67Specify data collection information (file name, storage location, panels, etc.).Click Acquire.Gate manually, if needed.Print or export results, if needed.运行质控 调用条件运行软件关闭软件分